利用高通量筛选鉴定激酶-底物配对

本实验的总体目标是利用高通量筛选方法，鉴定能够磷酸化特定底物的激酶。首先，将表达激酶融合谷胱甘肽S-转移酶（GST）的质粒转染细胞；第二步，进行GST激酶下拉实验。

接下来，将样品加入凝胶中，电泳运行后用考马斯亮蓝染料染色。最后一步是将凝胶干燥并暴露于放射自显影胶片。通过显影和分析所得胶片，可以鉴定激酶-底物配对关系，因为每条泳道代表一个独立的激酶检测。

目前用于鉴定已知磷酸化底物的激酶的方法包括：利用生物信息学方法在底物中搜索保守位点，通过生化技术检测激酶与底物之间的复合物并结合试错法，以及基于已知生物学功能寻找共有底物。这些方法耗时较长，且并不总能成功。我们的方法能够基于功能结果快速鉴定激酶-底物配对关系。

当我们最初提出这一方法时，我们曾担心体外实验的特异性可能不足。但事实证明，底物特异性非常理想，我们经常发现只有同一激酶家族的成员才能在筛选中对特定底物进行磷酸化。当我们在每次筛选中采用多种底物进行多重检测时，这一特性尤为明显。接下来，由我实验室的技术员 Courtney 开始实验操作，首先按照文本方案中的描述准备试剂、培养板和细胞。

若含有激酶质粒的板已冷冻，请在室温下解冻，并在1900 × g下离心3分钟，以收集孔底部的任何冷凝液。将8.6毫升低血清培养基与312.7微升脂质转染试剂混合，室温静置5分钟。向每孔中加入10微升该混合物至含有激酶质粒的96孔板中。

使用配备小体积卡匣的自动液体分液器，每孔加入 10 µL 低血清培养基-转染试剂混合物，加入后让培养板静置 20 至 45 分钟。接着，将 293T 细胞重悬于 80 mL 完全 DMEM 培养基（Dulbecco's Modified Eagle Medium）中，调整细胞密度为 75 万个细胞/毫升，每孔加入 100 µL 细胞悬液。使用配备标准体积卡匣的自动液体分液器，加样后在显微镜下检查各孔细胞分布是否均匀，然后将培养板放回 37°C 培养箱中培养 24 小时。

开始 GST 激酶下拉实验。取 60 微升 0.2 摩尔的钒酸钠与 540 微升水在另一管中混合，配制四毫摩尔的钒酸盐溶液；再在另一管中混合 2.7 微升 30% 过氧化氢和 1.4 毫升磷酸盐缓冲液（PBS）。将两种溶液混合，室温静置 15 分钟后使用。

使用多通道移液器，向每个孔中加入 2 微升 0.25 摩尔的氯化钙，随后加入 2.5 微升已验证的日期溶液。将每块板在 37 摄氏度下孵育 10 分钟，然后置于冰上，并保持板在冰上。使用真空装置从每个孔中移除培养基，立即每孔加入 50 微升冰浴裂解缓冲液。

使用配备标准盒的自动液体分配器，将酶标板置于冰上静置30分钟以进行裂解。在4°C条件下以1900 × g离心3分钟后，用多通道移液器刮下每个孔中的细胞，并将所有内容物转移至相应标记的vbo中。对于96孔板，在4°C条件下以1900 × g离心10分钟的同时，向每孔中加入100 µL预冷的裂解缓冲液，填充经谷胱甘肽包被的酶标板。

作为冲洗步骤，将平板保持在冰上。将底部的平板离心后，将谷胱甘肽平板倒置在水槽上方，轻轻摇晃以去除裂解缓冲液，并用纸巾轻压吸干。通过倾斜V型底平板，使用多通道移液器将裂解缓冲液转移至谷胱甘肽平板中，注意不要扰动底部的沉淀物。

然后用盖子盖好培养皿，置于冰上至少两小时。在接近两小时结合步骤结束前，准备放射性工作站，并确保已采取放射性工作所需的必要安全防护措施。将杂交炉温度设置为30摄氏度。

将谷胱甘肽平板倒置在水槽上方，轻轻摇晃以倒出裂解缓冲液，并用纸巾吸干。用不含PMSF的裂解缓冲液每孔100 µL清洗三次。切勿让孔板干燥。

在准备进行下一步之前，将其置于洗涤液中。接下来，按照文本方案中的说明配制55毫升的1倍激酶缓冲液（1× kinase buffer）或1× KB。使用配备标准体积盒的自动液体分配器，向每孔中加入50微升1× KB。

然后，按照文本方案中的说明，依次配制含有目标底物以及髓鞘碱蛋白或MVP的溶液，制备溶液A。将平板倒置在水槽上方，用纸巾吸去一次XKB漂洗液，立即使用配有小体积盒的自动液体分配器加入30 µL溶液A。保持平板置于冰上。

接下来，在放射性工作区域按照文本方案中的说明配制溶液B，每孔加入20 µL溶液B。使用多通道移液器，借助其排液力促进混匀，随后将酶标板置于30 °C的杂交炉中孵育30分钟。30分钟后，将酶标板转移回冰上。

然后使用多通道移液器向每个孔中加入 50 µL 的 2× 柠檬酸钠-十二烷基硫酸钠（SDS）裂解缓冲液。本节所有操作均应在指定的放射性工作区域进行。打开杂交炉并将其温度设置为 85 °C。

当烤箱达到设定温度后，将平板转移至烤箱中，孵育10分钟以使样品变性。随后，将每个反应的15微升样品加入26孔预制胶中上样。

使用多通道移液器同时填充多个孔时，必须确保所有吸头与相应的孔对齐。在加入样品前，先以150伏电压预电泳运行凝胶。切勿让蓝色条带跑出凝胶底部，因为其中含有未掺入的ATP。然后拆卸凝胶，并去除未掺入的ATP，否则其会导致胶片曝光时凝胶背景变深。

将凝胶放入已标记的容器中，加入考马斯亮蓝染液，染色15分钟。随后，去除考马斯亮蓝染液，用清水短暂漂洗凝胶，然后加入脱色液。

待蛋白条带清晰可见后停止电泳。每个样品应可见MVP条带和底物条带。为干燥凝胶，裁剪一张较大的滤纸并置于凝胶干燥器上。

将玻璃纸片浸入蒸馏水中，直至其变得平滑且无皱褶，然后将其放置在纸张表面。将凝胶依次放置在玻璃纸片上，并记录凝胶的排列顺序。用另一张玻璃纸片浸湿后覆盖在凝胶上方。

排出所有气泡，以获得平整均匀的表面。合上盖板，开启真空，于80摄氏度下电泳运行凝胶3小时。待凝胶干燥后，使用增感屏将其暴露于双乳化自显影胶片上以增强信号。

将胶盒用保鲜膜或塑料袋包裹，并用胶带密封，以防霜冻，随后于 -80 °C 冰箱中过夜保存。次日，从冷冻箱中取出胶盒，在室温下静置解冻。在暗室中按照所示制造商说明书，使用胶片处理器显影胶片。

以下是筛选180种激酶的代表性结果，实验中使用了GST标记的肽段底物，该肽段对应于Krebs调控的转录共激活因子2（CRTC2）的第268至283位氨基酸，以及经典的激酶检测底物——髓鞘碱性蛋白（MBP）。结果显示，MARK2激酶以及与其高度同源的MARK3激酶均发生了磷酸化。在所有实验中均包含CRTC2肽段和MBP作为内参对照，因为它们含有多个可被磷酸化的残基，并且在凝胶中迁移至底部附近，分子量约为18千道尔顿。

这有助于对特异性的解读。某些激酶会强烈磷酸化底物和MVP。值得注意的是，仅含有GST的孔始终会纯化出一些内源性激酶活性。

因此，该检测中始终存在背景磷酸化。尽管这并不排除底物磷酸化的真实性，但提示在体外环境中，激酶的选择性可能较低。为得出关于激酶底物特异性的结论，建议同时使用多种分子量不同的底物进行实验。

由于该筛选是在体外进行的，而体内存在更复杂的多层调控机制，因此必须在细胞中对候选激酶进行验证。例如，某个候选激酶可能在体外具有磷酸化底物的能力，但在体内可能并不在与底物相同的细胞类型或同一区室的相同亚细胞区域中表达。这一验证通常通过RNAi介导的候选基因沉默来实现。

还可以使用底物的非磷酸化相关突变体进行二次筛选，以确认特异性。