利用稳健的生化方法对一种新型激酶蛋白进行分子水平表征

免疫沉淀是一种用于分离和纯化目标蛋白的强有力技术。在适宜条件下，蛋白质、调控因子或底物可能被共免疫沉淀，从而发现新的相互作用网络。

也可评估免疫沉淀蛋白的活性。特别是可通过P32-ATP标记来检测激酶在不同底物上的活性。此外，可评估靶向参与疾病过程的激酶的抑制剂的活性。

它们可能作为先导化合物用于开发新药。该方法可从哺乳动物扩展至酵母或细菌。这种技术并不十分困难。

关键要点：务必设置阴性对照，以确保检测到的相互作用具有特异性；并仔细选择裂解条件，以维持分子间的相互作用及活性。细微的操作细节和手法对于该技术的成功至关重要，但这些内容在文章的材料与方法部分往往未被详细描述。本实验操作将由本实验室的技术员 Fabienne Godin 进行示范。

在生物安全柜内的细胞培养室中准备好细胞后，使用10毫升移液管从培养板中移除培养基，并将其弃置到含有漂白剂的专用废液瓶中。然后，向每孔加入10毫升新鲜的含补充物的DMEM培养基，将培养板放回37摄氏度的培养箱中。为制备转染混合液，在一个15毫升离心管中加入450微升pH 7.5的10毫摩尔Tris盐酸溶液（含1毫摩尔EDTA），以及50微升2.5摩尔氯化钙溶液。

通过倒置混匀。向离心管中加入相当于10微克血浆DNA的体积，该DNA经DNA中量提取试剂盒扩增，并用该试剂盒的洗脱缓冲液稀释，且其浓度已测定。倒置离心管以混匀。

然后，在旋涡混合器上轻轻振荡，将500微升2倍浓缩的BES缓冲盐溶液逐滴缓慢加入离心管中。操作时需格外小心，避免干扰DNA与磷酸钙之间的复合物形成。室温下孵育至少15分钟，最长可至45分钟。

现在，将培养板从培养箱转移至生物安全柜中。将预先配制好的DNA复合物逐滴均匀地加入到培养板表面的细胞中。随后在37摄氏度的培养箱中孵育24至72小时。

为防止蛋白质降解，需在冰上配制裂解缓冲液，每块转染的培养板需准备 4 毫升裂解缓冲液。从培养箱中取出转染细胞的培养板，吸去培养基，并将其弃置到专用的含氯漂白剂废液瓶中。

洗涤细胞时，将三毫升冷的 PBS 沿培养板壁逐滴加入，避免转染的细胞脱落。然后轻轻摇晃培养板，使缓冲液均匀覆盖整个表面。倾斜培养板以去除 PBS，并将其弃入废液瓶中。

再重复洗涤一次。将培养板置于冰上。最后，小心吸除剩余的 PBS。

接着，向转染并洗涤过的细胞中加入 500 µL 冷裂解缓冲液，使其均匀覆盖培养板表面，在冰上孵育 10 分钟。

不时地，再次将缓冲液均匀铺满培养板表面。随后，使用细胞刮刀将细胞从表面刮下，并收集至微量离心管中。在 10,000 ×g 及 4 °C 条件下离心 10 分钟。

将上清裂解液收集到新的微量离心管中，并取该组分的50微升等分试样至另一个新的微量离心管中。此等分试样将用于检测转染蛋白是否表达良好。将沉淀丢弃至垃圾桶中。

首先，轻轻重悬与适当抗体偶联的琼脂糖微珠储备液。剪切200微升枪头的末端，使其形成一个1至2毫米的开口。将枪头连接至移液器，并吸取40微升溶液，使微珠进入枪头。

用移液器将珠子上下吹打数次，以充分润洗吸头，确保珠子体积准确，然后将珠子转移至微量离心管中。加入 500 µL TNET 缓冲液，通过倒置混匀，于 1,000 ×g、4 °C 离心 2 分钟。小心去除上清液，再加入 500 µL TNET 缓冲液。

在4°C条件下，于旋转仪上孵育至少一小时。然后，在4°C、1,000 × g 条件下离心2分钟，并用500 µL裂解缓冲液将磁珠上下颠倒洗涤两次。洗涤后，将先前收集的总组分裂解液转移至该管中，在4°C条件下于旋转仪上孵育2至4小时。

现在，将含有免疫沉淀珠的离心管在4°C条件下以1,000 × g离心两分钟。用500微升裂解缓冲液上下颠倒并离心，重复洗涤珠子五次。洗涤珠子时，在移除上清液的过程中应注意不要过于接近珠子。

否则，珠子将被吸走，实验结束时将不再有珠子残留。洗脱时，首先在 1,000 ×g 和 4 °C 条件下离心两分钟。使用 1 毫升微量移液器小心移除上清液。

然后，使用带有固定针头的汉密尔顿注射器，吸除上清液的最后几滴，以避免吸入磁珠。接着，加入40 µL 4X Laemmli缓冲液。通过轻轻敲击离心管使其充分混匀。

室温孵育5分钟。然后在室温下以10,000 × g离心5分钟。使用Hamilton注射器将上清液转移至新的微量离心管中。

在 -80 摄氏度下保存。使用无标签的 LIMK 2-1 或带有 HA 标签的 LIMK 2 亚型之一转染 HEK-293 细胞。在不同条件下，LIMK 2-1 均表达良好。

抗LIMK 2-1抗体不识别LIMK 2a和LIMK 2b亚型，且具有特异性，因为与转染对照小干扰RNA的细胞相比，转染LIMK2小干扰RNA的细胞中该抗体的信号减弱。在多种人源细胞系中，LIMK 2-1在HEK-293和HeLa细胞中表达，但在C6细胞中不表达。通过共免疫沉淀实验评估了LIMK2-1与上游激酶ROCK之间的相互作用。转染载体所编码的各种不同蛋白质均得到良好表达。

LIMK2 的三种同工型以及 larp6 均被有效免疫沉淀。在洗脱液中检测到 ROCK，并且与 LIMK2 的三种同工型共免疫沉淀，但未与 larp6 共免疫沉淀。因此，所检测到的相互作用具有特异性。

通过γ-P32 ATP标记检测共免疫沉淀的LIMK 2-1的激酶活性。LIMK 2-1不能磷酸化cofilin，但能够磷酸化髓鞘碱性蛋白（myelin basic protein，MBP）。在此实验中，LIMK 2-1可被高效地免疫沉淀。

进行免疫共沉淀时，必须设置阴性对照，以确保相互作用的特异性。裂解缓冲液的成分需精心配制，以维持蛋白质间的相互作用及活性。免疫共沉淀后，可通过激酶活性检测来鉴定不同的底物。

可轻松引入突变，以揭示特定残基的作用。也可开展功能研究，以理解新发现的相互作用的生理功能。细胞必须在生物安全柜内的专用培养室内进行培养。

P32 ATP 需要特别小心处理。应使用屏蔽装置以防止辐射，配备盖革计数器，专用放射性废物收集容器，佩戴个人胸部和手指剂量计以检测放射性暴露，并使用带滤芯的吸头。