寡肽竞争法测定磷酸化位点

本实验的总体目标是同时评估多个潜在的磷酸化位点，并鉴定出可用于后续磷酸化位点突变体验证的关键位点。该方法有助于解答生物化学与细胞生物学领域中的关键问题，即翻译后修饰在细胞信号转导中的作用。该技术可对目标蛋白的磷酸化位点进行简便且经济的初步筛选。

该技术的应用延伸至炎症和癌症等疾病的诊断与治疗，因为磷酸化是人类疾病信号通路中的重要生化事件。演示操作将由我实验室的研究生 Sol-Bi Shin 协助完成，她将进行定点突变实验。首先，在冰上混合 50 纳克 pGEX JST NRF2 质粒、125 纳克正向引物、125 纳克反向引物、1 微升 dNTP 混合物、2.5 单位 PFU DNA 聚合酶以及 10x 反应缓冲液。

加入无菌蒸馏水至终体积为 50 微升。进行 PCR 以引入突变链，然后将样品置于冰上冷却两分钟。向冷却后的样品中加入 1 微升 DPNI 限制性内切酶。

用移液器轻轻混匀样品，然后在13,000 × g条件下离心样品1分钟。将样品在37°C孵育2小时，以消化亲本双链DNA。随后将含有endA1和RACA1突变的超感受态E.coli细胞置于冰上。向预冷的细胞中加入50 µL反应混合物，冰上孵育30分钟。

同时，将加热块预热至 42 摄氏度。完全孵育后，在 42 摄氏度下加热混合物 90 秒，然后将混合物置于冰上冷却 2 分钟。向转化后的细胞中加入预热的LB培养基。

将混合物在37摄氏度、180转/分钟振荡条件下孵育1小时。随后将细胞涂布于含氨苄青霉素的LB琼脂平板上，于37摄氏度过夜培养。挑取单菌落接种至5毫升含氨苄青霉素的LB液体培养基中。

将样品在37摄氏度、180 RPM振荡条件下孵育过夜。使用标准质粒小提试剂盒提取样品DNA用于DNA序列分析。在DNA分析仪中上样至少200纳克的HDNA构建体，以确认突变序列。

表达并纯化经验证的突变型NRF2蛋白。在进行激酶活性检测之前，确定所产生的突变型NRF2蛋白的量。为开始肽竞争实验，配制含有500微摩尔腺苷一磷酸的5倍浓度激酶缓冲液。

然后解冻AMPK野生型人NRF2的冷冻样品以及三种模拟NRF2上AMPK磷酸化位点的寡肽。对于每种肽，在冰上操作，将0.43毫克肽与0.15微克AMPK、0.4微克NRF2以及6微升5X激酶缓冲液混合。加入无菌蒸馏水，使终体积达到30微升。

然后在屏蔽区域内，将加热块设置为 30 摄氏度。向每支试管中加入一微居里的 γ-³²P ATP，并通过反复吹打充分混匀各溶液。将反应混合物在 30 摄氏度下孵育 15 至 30 分钟。

孵育期间，制备7.5% STS PAGE凝胶。然后向每根试管中加入3微升10X STS上样缓冲液，充分混匀以终止激酶反应。将样品先以70伏电压在凝胶中电泳20分钟，随后以140伏电压继续电泳1小时。

完成凝胶电泳后，小心地切下溴酚蓝条带下方的高放射性凝胶。将凝胶从制胶板轻轻转移至玻璃管中。用含有50%甲醇、40%水和10%乙酸的固定液固定凝胶20分钟。

然后将凝胶轻轻放置在滤纸上，并用透明塑料膜覆盖。在80°C条件下，使用真空凝胶干燥仪干燥凝胶一小时。将干燥后的凝胶分别暴露于磷屏或X射线胶片，时间约为16小时或两天。

使用磷光成像仪生成屏幕的高分辨率 TIFF 或位图文件。开始 AMPK 活性检测时，将 AMPK 样品以及突变型和野生型 GST NRF2 样品置于冰上解冻。将 0.4 微克突变型 GST NRF2 与 0.15 微克 AMPK 及 6 微升 5X 激酶缓冲液混合。

加入无菌蒸馏水至终体积为 30 微升。用 0.4 微克野生型 GST NRF2 以相同方法配制另一份反应混合液。向每个反应管中加入 1 微居里的 γ-³²P ATP。

用移液器将混合物上下吹打数次，然后短暂离心。将混合物置于屏蔽区域中，30 摄氏度孵育 30 分钟，随后加入 3 微升 10X STS 上样缓冲液终止激酶反应。进行 STS PAGE 电泳，固定凝胶，并采用与竞争性激酶实验相同的条件干燥凝胶。

将凝胶在磷屏上曝光过夜，并使用磷光成像仪扫描磷屏。体外AMPK激酶实验在三种模拟人NRF2上AMPK磷酸化位点的10个残基寡肽存在下进行。模拟丝氨酸558位点的寡肽对AMPK磷酸化表现出最强的竞争性。

随后合成了将丝氨酸558替换为丙氨酸的NRF2突变体，并在体外活性实验中进行了评估。实验观察到S558A突变体的AMPK磷酸化水平极低，表明AMPK可直接在丝氨酸558位点磷酸化人源NRF2。由于肽段可与蛋白质发生竞争性结合，该方法的原理也可应用于鉴定其他翻译后修饰，如乙酰化修饰和赖氨酸残基修饰，以及蛋白质-蛋白质相互作用。

请注意，操作放射性同位素可能具有极高危险性。在进行本实验前，必须已完成放射性同位素安全培训。