ABCG5/G8 在脂质双层胶束环境中的X射线晶体学结晶

您好，我们团队研究的是一类跨细胞膜的蛋白质，正在探索其与医学和生物学之间的关系。具体而言，我们关注一种需要利用ATP驱动其功能的特定蛋白质，这类蛋白质的一部分被称为ATP结合盒转运蛋白（ATP-binding cassette transporter）。我们尤其致力于研究它们的基本结构与功能关系，并利用这些知识来深入理解多种慢性疾病，特别是心血管疾病。

由于膜蛋白的纯化过程复杂，且其在天然温度下的稳定性较差，获得三维蛋白质晶体是该领域的主要挑战，同时也限制了药物发现的应用。我们团队已建立了用于膜转运蛋白结构研究的冷冻电镜（cryo-EM）和X射线晶体学方法。此前，我们的实验室还解析了首个人体ABCG5/G8必需异源二聚体在无配体（APO）状态及胆固醇结合状态下的晶体结构。

我们的研究结果可能为小分子药物发现或药物再利用带来突破。获得蛋白质的三维晶体后，还可进行浸泡实验，以实现蛋白质与配体复合物的共结晶。我们实验室的目标是阐明ATP依赖性脂质转运蛋白在脂质识别与转位过程中的分子机制。

我们还致力于建立研究ABC转运蛋白分子动力学和结构特征的药物开发新方法。首先通过还原甲基化对混合的蛋白质组分进行化学修饰。具体操作为：取纯化的蛋白质，加入20毫摩尔的二甲基胺硼烷，随后加入40毫摩尔的甲醛。

将混合物置于振荡摇床中，在4°C下孵育两小时。然后，向混合物中加入额外的10毫摩尔二甲基胺硼烷。接着，在4°C下继续孵育混合物过夜，时间为12至18小时。

加入 pH 为 7.5 的 100 毫摩尔 Tris 盐酸盐以终止反应。使用适当的洗涤缓冲液和洗脱缓冲液将甲基化蛋白上样至镍 NTA 柱。首先，用 10 倍柱体积的洗涤缓冲液洗涤 2 毫升镍 NTA 柱。

然后用洗脱缓冲液洗脱蛋白质。洗脱后，将蛋白质洗脱液通过已用适当缓冲液预平衡的PD-10脱盐柱。向脱盐后的蛋白质中加入用异丙醇或乙醇配制的胆固醇。

在4°C下孵育混合物过夜。次日早晨，在4°C条件下以150,000 ×g超速离心10分钟。将收集的上清液加入截留分子量为100 kDa的离心浓缩管中，浓缩至上清液终浓度为30至50 mg/mL。

再次使用高速台式冷冻离心机离心浓缩后的蛋白质，并弃去沉淀。将收集的上清液置于冰上，于4 °C保存，随后进行结晶实验。在一个月内，通过分析型凝胶过滤色谱分析储存在4 °C的烷基化蛋白质。

一周后显示出轻微的蛋白质损失。首先配制10% B-细胞储存液，其中包含脂质和去垢剂。具体操作为：取预先干燥的脂质（由5摩尔百分比的胆固醇和95摩尔百分比的DMPC混合而成），加入去离子水中的CHAPSO去垢剂溶液。

使用水浴超声仪，在冰浴条件下持续超声处理脂质-去垢剂混合物，直至溶液澄清。然后，借助0.2微米离心滤膜，去除未溶解的组分。接下来，在冰上操作，将所得B细胞储备溶液与预先制备的蛋白质样品按1:4的体积比混合。

将蛋白B细胞混合物置于冰上孵育30分钟。在48孔板中进行结晶时，取0.5或1微升蛋白B细胞混合物，与等体积的结晶储备液混合。然后采用悬滴蒸汽扩散法，在48孔板中设置结晶实验，并将结晶装置在20摄氏度下孵育。

次日，检查结晶板，确保盖玻片密封良好。每天至少使用配备偏光镜的体视显微镜观察一次晶体生长情况。最后，将蛋白质晶体浸泡于 0.2 摩尔的丙二酸钠溶液中，并用液氮在 50 或 100 微米的冷冻环中进行快速冷冻。

适合进行数据收集的成熟晶体通常在一到两周内出现，一般尺寸为50微米×100微米×2微米。