使用竞争实验比较GTP酶结合蛋白的亲和力

本实验的总体目标是在严格控制核苷酸加载条件的情况下，比较蛋白质结合伴侣对Ras家族GTP酶的相对亲和力。该目标通过以下步骤实现：首先纯化假定的竞争性结合伴侣，每个伴侣均标记相同的标签，例如绿色荧光蛋白（GFP）；第二步是纯化目标GTP酶。

例如，将 RAC1 与适当的核苷酸孵育，以获得所需的 GTP 酶信号状态。接着，将加载了核苷酸的 GTP 酶与固定量的一种结合竞争物以及递增浓度的另一种结合竞争物共同孵育，以获得滴定结合曲线。最后一步是通过 Western 印迹分离与固定化 GTP 酶结合的蛋白质，并利用两种结合伴侣共有的 GFP 标签对膜进行探针检测。

最终，Western blot 用于确定每种GFP标记的结合伴侣蛋白被GTPase捕获时的相对浓度。该技术相较于共沉淀等现有方法的主要优势在于，GTPase的蛋白质结合特性由细胞内所结合的核苷酸决定。然而，由于所结合的核苷酸具有不稳定性，使得蛋白质结合数据的解读变得困难。

按照文本方案中的说明，首先纯化 GST 标签的 G tpa 并表达 gtpa 结合蛋白。用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗转染细胞的培养瓶，并将液体沥干五分钟。吸除残留液体后，加入 500 微升裂解缓冲液刮取细胞，转移至微量离心管中，在 4°C 下通过颠倒混匀裂解细胞，持续 30 分钟。

在裂解过程中，将两份各40微升的GFP捕获珠用新鲜裂解缓冲液分别洗涤三次，每次洗涤之间以2,700 × g离心两分钟。裂解完成后，将裂解液在21,000 × g下离心10分钟以澄清。

将每种竞争蛋白的澄清裂解液分别转移至已洗涤的GFP捕获珠中。在4°C下轻轻翻转混合，孵育两小时，使GFP融合蛋白结合。用裂解缓冲液洗涤负载的GFP捕获珠两次，再用竞争缓冲液洗涤两次。

每次洗涤之间，将结合缓冲液中的珠子在2,700 × g下离心2分钟。通过加入40微升0.2摩尔的甘氨酸并上下吹打30秒来洗脱GFP融合蛋白，立即在21,000 × g下离心60秒，将上清液转移至含有4微升1摩尔Tris-HCl的新离心管中。此步骤需快速操作，以尽量减少对纯化蛋白的损伤。取1微升每种纯化的蛋白进行Western印迹分析，并使用抗GFP抗体进行杂交，根据制造商的说明书，利用定量印迹系统确定相对得率。

通过加入竞争性结合缓冲液，使蛋白摩尔浓度相等。取90微升制备好的GST Rack1珠子，使用磁性粒子分选仪在每步沉淀珠子，并用核苷酸加载缓冲液洗涤三次。从珠子中吸去缓冲液，然后根据是否需要GDP-GTP或无核苷酸加载，加入100微升核苷酸加载缓冲液。

进行竞争实验时，向60微升GST Rack1珠中加入12微升100毫摩尔/升GDP、12微升10毫摩尔/升GTPγS，或不加核苷酸，作为核苷酸负载对照。将剩余珠悬液均分为三份，每份10微升，分别向各管中加入2微升100毫摩尔/升GDP、2微升10毫摩尔/升GTPγS，或不加核苷酸。将珠悬液混合物在30摄氏度下振荡孵育30分钟。

向实验组和对照组反应体系中各加入一摩尔浓度的氯化镁，以稳定结合在支架上的核苷酸，从而进行竞争结合实验。准备六根微量离心管，每管含有 200 微升竞争结合缓冲液。

每个试管还应加入 10 µL 的核苷酸加样架、一粒磁珠和 5 µL 的加样架。向每个试管中加入 0、1、2、0.55、10 或 20 µL 的加样架一结合蛋白 A 作为恒定结合蛋白，同时加入加样架一结合蛋白 B 作为可变结合蛋白。这些体积基于恒定结合蛋白与可变结合蛋白的大致相等的储备浓度，可能需要根据实际情况进行调整。

加入竞争性结合缓冲液，将结合反应体系的总体积补至235微升。接着，准备一支微量离心管，其中加入200微升竞争性缓冲液、10微升实验核苷酸负载的RACK1珠粒，以及10微升RACK1结合蛋白A。然后按照文本方案中所述，设置GDP-GTPγS和无核苷酸对照管。

将试管在4°C条件下孵育两小时，孵育后通过倒置混匀。用竞争结合缓冲液洗涤磁珠三次。最后，用20 µL还原性上样缓冲液洗脱结合的蛋白质。

对纯化的GFP RCC2和GFP Corona C-Propeller结构域中GFP标签进行定量Western印迹分析，结果显示上条带（GFP RCC2）的蛋白丰度是下条带的1.4倍，因此在竞争实验中需稀释以达到1:1的摩尔比。对照实验表明，RACK1的核苷酸结合状态决定了其结合特异性：将等摩尔浓度的GFP Corona C-Propeller结构域固定，滴定加入不断增加体积的GFP RCC2，通过印迹检测与RACK1结合的蛋白。结合蛋白的相对变化可通过在同一图中绘制两种竞争蛋白的GFP条带强度进行可视化；通过确定两条曲线的交点，可确定平衡状态下可变结合蛋白的体积。

然而，必须注意确保竞争者之间的相互作用或过量的诱饵GTPA等问题不会影响实验结果。在尝试该实验过程中，若出现如本例中一个竞争者的信号增强而另一个未相应减少的情况，则表明存在问题。需要牢记的是，应验证相互竞争的结合伙伴的丰度之间是否存在此消彼长的对应关系。

有许多问题可能会扭曲结果，但只要通过检查数据能够识别出来，就可以得到解决。