利用膜组分分离和GTP酶联免疫吸附测定法检测小GTP酶的异戊二烯化及GTP结合能力

小Rho GTP酶是一类具有多种细胞功能的超家族蛋白。例如，这些蛋白参与调控细胞命运、细胞对压力的响应、细胞运动性以及细胞周期。小Rho GTP酶蛋白的活性受翻译后修饰的调控。

这些修饰参与对其活性的严格调控。例如，蛋白质预酰化和GTP结合是这类蛋白最重要的翻译后修饰。我实验室近期改进并建立了一种简单的方法，用于研究该蛋白超家族的翻译后修饰。

为此，我们使用了251种胶质母细胞瘤细胞系，用辛伐他汀进行靶向处理，并检测了这些蛋白质的翻译后修饰。该方法包括亚细胞分级分离以及检测与该蛋白质超家族结合的GTP结合蛋白。为此，我们通过检测RhoA的定位及其与GTP的结合情况，来评估该蛋白的翻译后修饰水平。

从37摄氏度的培养箱中取出细胞。在显微镜下观察细胞以确认汇合度。细胞汇合度应达到70%至80%。

用预冷的PBS洗涤细胞一次。加入5 mL EDTA，将细胞放回37摄氏度培养箱中孵育5分钟。孵育5分钟后，将含细胞的EDTA收集至15 mL离心管中。

将试管放入冰盒中，然后进行离心。将离心机设置为4°C、1500g，离心5分钟。离心结束后，弃去上清液，加入1毫升冷的PBS。

充分吹打混匀细胞。将细胞混合液转移至一个新的已标记的1.5毫升离心管中。转移后，立即进行离心处理。

将离心机设置为4°C、1500g，离心细胞5分钟。检查沉淀大小。将样品置于冰上。

彻底弃去上清液，切勿扰动沉淀。加入缓冲液一，通过反复吹打充分混匀。

进行超声处理。将超声仪设置为五个循环，每个循环5秒，重复三次。超声处理应在冰上进行，但为便于说明，视频中未展示此步骤。

将样品转移至超速离心机。使用超速离心机将细胞匀浆分离为胞质和膜组分。设置离心机在4°C条件下以100,000 ×g离心35分钟。

检查沉淀物的大小。分离上清液。完全收集上清液，注意不要扰动沉淀物。

上清液为胞质组分。将上清液转移至新标记的离心管中。向沉淀中加入缓冲液二。

此为膜组分。用移液器上下吹打充分混匀。随后进行蛋白质定量及Western blot样品制备。

使用15%凝胶进行SDS-PAGE电泳上样。通过观察分子量标记物或使用Ponceau染色来确认蛋白质转膜效果。加入一抗进行免疫印迹分析。

我们使用 Rac1/2/3、Cdc42 和 RhoA。将培养板从培养箱中取出，在显微镜下观察细胞以确认汇合度。

细胞应达到70%至80%的融合度。将培养板置于冰上，吸除培养基，并用预冷至4 °C、pH值调至7.2的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞。

吸除 PBS。将培养板在冰上倾斜放置额外 1 分钟，以彻底去除残留的 PBS。残留的 PBS 会对本实验产生不利影响。

在含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的适量预冷裂解缓冲液中裂解细胞。用细胞刮收集细胞裂解液。进行此操作时，将培养板倾斜。

将裂解液转移至预冷的、已标记的冻存管中，并置于冰上。使用涡旋振荡器充分混匀。保留10 µL裂解液用于蛋白质定量分析。

将剩余的细胞裂解液在液氮中快速冷冻。将速冻后的冻存管转移至-80 °C冰箱中。保存这些样品。

注意，样品保存时间不应超过14天。按照步骤一至八，逐一从其他培养板中制备细胞裂解液。操作需迅速，切勿将样品在冰上放置超过10分钟。

切勿同时操作所有培养皿。测定蛋白质浓度。计算裂解缓冲液体积，以使各样品间的蛋白质浓度归一化。

注意：通常每毫升一毫克为最佳浓度，但每毫升0.3至2毫克也可被检测到。通过向一个微量离心管中加入60微升裂解缓冲液和60微升结合缓冲液，制备空白对照。通过向一个微量离心管中加入12微升Rho对照蛋白、48微升裂解缓冲液和60微升结合缓冲液，制备阳性对照。

将 Rho 亲和板从袋中取出并置于冰上。用 100 微升冰冻蒸馏水溶解各孔中的粉末。保持该板置于冰上。

将速冻的细胞裂解液在25摄氏度的水浴中解冻。向每个样品中加入计算好的冰上预冷的裂解缓冲液体积，以标准化蛋白浓度。将60微升标准化的冰上预冷样品转移至微量离心管中，并加入60微升结合缓冲液。

充分混匀后置于冰上。用力甩动微孔板以彻底去除孔中液体，随后在实验台垫上用力敲击5至7次。每孔加入50 µL标准化样品、空白对照和阳性对照，均设复孔。

将培养板置于4°C的轨道摇床上震荡30分钟。注意：摇床速度应设置为300 rpm。通过轻弹去除板中的样品，并用200 µL室温洗涤缓冲液洗涤两次。

每次洗涤后，通过轻弹并随后轻拍的方式彻底去除孔中的洗涤缓冲液，并将板置于室温下的实验台上。向每孔中加入200 µL室温抗原呈递缓冲液，在室温下孵育2分钟。将孔中的溶液轻弹弃去，再用200 µL室温洗涤缓冲液洗涤3次。

向每个孔中加入 50 微升新鲜配制的 1:250 稀释的抗 RhoA 一抗。将酶标板置于摇床上，25 摄氏度、300 转/分钟孵育 45 分钟。弃去孔中溶液，用 200 微升洗涤缓冲液在室温下洗涤三次。

向每个孔中加入 50 微升新鲜配制的 1:250 稀释的抗 RhoA 二抗。将板置于摇床上，25 摄氏度、300 转/分钟振荡孵育 45 分钟。通过混合等体积的试剂 A 和试剂 B 配制 HRP 检测试剂。弃去每孔中的溶液，用 200 微升室温洗涤缓冲液洗涤三次。

每孔加入 50 µL 新鲜配制的 HRP 检测试剂。在 3 至 5 分钟内读取化学发光信号，以获得最大信号值。使用适当的软件分析结果。

我们的结果表明，辛伐他汀减少了 RhoA 在膜组分中的定位，而增加了其在胞质组分中的积累。有趣的是，辛伐他汀增加了与 RhoA 结合的 GTP。为什么？

我们预期辛伐他汀会降低该活性。他们必须同时检测该蛋白的亚细胞定位以及该蛋白的GTP结合能力，以对小Rho GTP酶的活性做出最终评估。