从腺病毒感染的正常人细胞中分离富含病毒复制区室的核内组分

本实验的总体目标是从腺病毒感染细胞中获得富含复制区室的非核组分，以便对其组成、超微结构及相关活性进行深入研究。该方法有助于解决DNA病毒学领域的一些关键问题，例如研究调控病毒基因组复制和表达的分子机制，而这些过程又依赖于复制区室对病毒与宿主细胞相互作用的调控。该技术的主要优势在于，它是一种基于速度梯度的简单方法，可建立无细胞体系，便于研究核内复制DNA病毒如何掌控感染细胞的分子机制。

为了进行该实验，首先，按照随附的文字方案制备 5 型腺病毒（Ad5）和人包皮成纤维细胞（HFF），开始在 100 毫米组织培养皿中感染 10⁷ 个 HFF，每皿加入 1 毫升含 85 和 DMM 的培养基，感染复数（MOI）为每个细胞 30 个蚀斑形成单位（FFU），在 37°C、5% CO₂ 的湿润细胞培养箱中孵育 2 小时，每 15 分钟轻轻摇动培养皿一次，以确保病毒接种物在细胞表面均匀分布。孵育结束后，移除培养基，并加入新鲜 DMEM。

加入10% FBS后，使用细胞刮刀将细胞在16、24或36小时的不同时间点进行孵育。感染后，轻柔收集感染组和对照组细胞，并将细胞悬液收集于预冷的无菌离心管中，置于冰上。使用血细胞计数板（Neubauer计数室）对细胞进行计数，随后在4°C条件下，以220 × g离心5分钟。

接下来，将细胞沉淀重悬于 5 mL 冰冷的 PBS 中，离心，并用 5 mL 冰冷的 PBS 洗涤细胞三次，弃去洗涤上清液，以裂解细胞。将细胞沉淀重悬于 700 µL 含蛋白酶抑制剂的冰冷低渗缓冲液中，置于冰上孵育 3 小时，使细胞肿胀。使用 A 型聚四氟乙烯研杵，上下研磨 10 至 20 次，使细胞匀浆化。

每20次研磨后定期在显微镜下检查裂解液，以监测细胞裂解情况。重复该过程约80次，直至所有细胞完全破裂。随后将匀浆液在4°C条件下以300 × g离心5分钟。

将上清液储存于 -20 °C 的离心管中，作为细胞质组分，以去除细胞核重悬物中的细胞碎片。将沉淀物重悬于 750 µL 0.25 mol/L 蔗糖溶液一中，取 750 µL 0.35 mol/L 蔗糖溶液二置于离心管内，并小心地将重悬的匀浆液铺加在溶液二之上。在 4 °C 条件下以 1400 ×g 离心 5 分钟，随后弃去上清液。

将沉淀重悬于750微升的溶液二中。将核悬液置于超声波水浴中进行超声处理，在4摄氏度或更低温度下以两次5分钟脉冲进行。在两次脉冲之间于明场显微镜下检查核裂解情况，并继续超声处理直至细胞核完全裂解。

接下来，用移液器将750微升0.88摩尔的蔗糖溶液三加入离心管中，将核裂解液小心铺加在溶液三上层。在4摄氏度下以3000 × g离心10分钟。上层1.5毫升液体即为核浆组分，于-70摄氏度保存。

然后将沉淀重悬于700微升溶液二中。此为宿主细胞核的85复制区室组分（RCF），同样储存于-70摄氏度。开始进行免疫荧光分析时，取5微升RCF液滴加入经盐溶液包被的玻片上。

让液滴在室温下自然风干。然后在斑点旁滴加500微升PBS，倾斜载玻片使PBS流过斑点。从载玻片上移除PBS。

接下来，在室温下用含有5%牛血清白蛋白的500微升PBS封闭样品点，持续两小时。为去除多余的封闭液，向载玻片上的样品点轻轻加入500微升PBS，避免直接将液体加到样品上。重复洗涤三次。

接下来，在样本点上加入20微升针对病毒E2A DNA结合蛋白的稀释后一抗。盖上盖片以防止蒸发，并在室温下的湿化孵育盒中孵育两小时。随后，用含有0.02%吐温20的PBS轻柔洗涤样本三次。

完成这些洗涤步骤后，避免直接在样本上加样。将20微升荧光标记的偶联小鼠二抗直接加在样本上，在4摄氏度孵育一小时。在湿化盒中，向玻片加入500微升含0.02% Tween 20的PBS，同样避免直接在样本上加样。

然后加入两微升封片液，并将盖玻片倒置覆盖在样品上。用指甲油密封盖玻片的四周。在荧光显微镜下使用63倍物镜，在所用荧光染料的特定激发波长下观察切片。此处显示的是腺病毒E2A DNA结合蛋白（DBP）免疫荧光染色的结果。

含有DBP的结构位于病毒复制中心（rc）内，注意E2A DBP定位于复制中心内并呈绿色显示。此外，通过PCR检测感染后24小时和36小时的RCF与核质组分（NPL）中的病毒DNA，证实病毒DNA在RCF中富集。病毒GNA选择性地存在于RCF中，而不存在于NPL中。

有关腺病毒MNA在RCF中附加证据的文本，一旦掌握该技术，若操作得当，从收获感染细胞到分离RCF可在六小时内完成。在进行此操作时，务必始终将样品置于冰上，并通过明场显微镜监测匀浆、细胞核分离、超声处理以及亚细胞核组分分离等步骤。遵循本操作流程。

还可以采用其他方法，如逆转录聚合酶链式反应（R-T-P-C-R）和透射电子显微镜技术，以研究与病毒复制区室相关的病毒基因表达调控以及这些颗粒的超微结构。该技术有望为DNA肿瘤病毒学领域的研究人员探索改变细胞周期调控并促进病毒在人细胞中复制的分子机制提供新的途径。观看本视频后，您应能够充分理解如何从感染细胞的细胞核中分离病毒复制区室，以对这些病毒诱导的结构进行形态学、功能性和组成成分的研究。

请注意，使用 SAN 指示剂可能存在危险，进行此操作时应始终采取预防措施，例如佩戴耳罩。