使用量子点纳米颗粒的关联光镜与电镜技术

本方法的总体目标是通过将荧光免疫细胞化学信息与透射电子显微镜提供的超微结构形态相结合，获得相关联的光学显微镜与电子显微镜（CLEM）数据，实现于单幅图像中呈现。该方法有助于解答免疫细胞化学与病理学领域中的关键问题，例如特定目标蛋白与何种亚细胞结构相关联。该技术的主要优势在于，使用同一种量子点纳米粒子探针，即可获取目标蛋白的活体显微信号以及其在电子显微镜下的结构定位信息。

根据文本方案对人源生长抑素瘤组织进行固定、包埋和切片后，通过将20厘米透明胶带放入含有2.0毫升丙酮的5毫升瓶中，配制切片粘附液，静置10分钟。取出胶带，将镍网浸入该溶液中，随后取出镍网并使其自然风干。干燥后，用镍网的哑光面拾取超薄切片。

确定所选树脂配方的正确蚀刻时间至关重要。该配方以30分钟为宜，但对于更硬或更软的配方可能需要重新计算时间。用蒸馏水配制一毫升新鲜的饱和过碘酸钠蚀刻溶液，并将溶液滴加到干净的实验室薄膜表面。

将完全干燥并带有切片的载网置于液滴上，在室温下孵育30分钟。随后，将载网转移至蒸馏水液滴中清洗60秒。为在洁净的实验室薄膜表面进行抗体与量子点（QD）标记，用移液器滴加0.05摩尔的甘氨酸和PBS液滴。

将载网置于液滴上，孵育10分钟，以封闭切片上残留的醛基。为去除醛基封闭液，短暂用滤纸吸去载网边缘的液体。随后将载网置于含1%正常山羊血清（NGS）和1% BSA-C的PBS液滴上，孵育10分钟。

通过将10微升NGS和100微升BSAC加入890微升PBS中，配制1毫升封闭液。然后，将切片置于抗体稀释液液滴上孵育10分钟，进行预处理。接着，用抗体稀释液按1:10比例稀释抗生长抑素多克隆抗体，并将网格置于该溶液的液滴上。

室温下于湿盒中孵育一小时。孵育结束后，用吸水纸从网格边缘吸去抗体试剂。随后用抗体稀释液洗涤切片两次，每次五分钟。

将二抗稀释至1:10并制备液滴后，将载网置于液滴上，室温孵育1小时。随后去除抗体溶液，洗涤切片两次。将链霉亲和素偶联的量子点稀释至1:10，在避光、室温条件下将样品置于该溶液液滴上孵育1小时。

然后用抗体稀释液洗涤载网两次，每次五分钟，并用滤纸吸干载网边缘。接着用蒸馏水洗涤载网两分钟，再吸干边缘水分。将免疫染色后的载网切片置于载玻片上的水滴中，用玻璃盖玻片封片。

进行荧光显微镜观察时，插入具有以下特性的滤光立方体，并使用365纳米LED照明。将免疫荧光染色的切片置于荧光显微镜载物台上。利用光学显微镜评估标记模式、非特异性标记的程度，并确认阴性对照无背景信号。

接下来，根据网格线确定感兴趣区域（ROI）。然后将全彩数字相机设置为FL自动彩色模式，并将白平衡设为3,200 K。将相机设为自动曝光模式，伽马值设置在0.45至1.00之间，以优化图像显示效果，模拟增益设为1×。在ZEN Two Light软件图形界面中点击相机图标以进入实时预览状态。随后对图像进行对焦，并在ZEN Two Light软件图形界面中点击“Snap”以将图像捕获至帧存储器中。

将图像保存为 tf 文件，以避免压缩和像素化。准备一张打印图，显示 ROI 相对于网格线或其他重要组织解剖标志的位置。然后从载玻片上移除网格，用蒸馏水清洗，并轻轻吸干边缘。

进行透射电子显微镜观察时，将载网转移至显微镜中，使用100千伏的加速电压进行检测。首先以约1,400倍的低倍镜观察，以便在载网上移动并定位在光学显微镜下已发现的感兴趣区域（ROIs）。在70,000倍或更高放大倍数下观察单个量子点（QDs）。

它们将呈现为具有中等电子密度的不规则晶体结构。然后，在成像软件的图形界面中，使用配备单色1,392 × 1,040像素传感器的数字相机，单击相机图标将其打开以采集图像。将相机图标移至关闭位置，以将图像存储至帧存储器中。

为了进行CLEM成像，利用光学显微镜成像的打印结果，通过透射电子显微镜（TEM）定位相应的感兴趣区域（ROI）。组织结构特征有助于在切片中进行导航。使用透射电子显微镜（TEM）拍摄相应感兴趣区域（ROI）的图像。

接下来，为了制备CLEM图像，需确保透射电子显微镜（TEM）图像的方向正确，并放大至与光学显微镜图像相同的尺寸和分辨率，本例中为每英寸300像素。将光学显微镜图像的画布尺寸扩展为原来的两倍，然后将TEM图像复制并粘贴到荧光图像旁边。

在 Photoshop CS2 中创建荧光叠加图像时，单击矩形选框工具，选择荧光图像，并从中创建一个副本图层。将图层样式混合选项的透明度调整为 30% 至 40%。然后单击移动工具，将荧光叠加图层拖动到相应的透射电子显微镜（TEM）图像上，并对齐图像。

对齐图像后，将图像压平以生成最终的叠加图像。然后使用矩形选框工具选择新的叠加图像，并将其复制到新画布上。最后，将图像保存为 tf 文件。

在这张荧光显微镜图像中，单个生长抑素瘤肿瘤细胞含有丰富的分泌颗粒，并对生长抑素激素呈阳性标记。细胞核呈现为深色空洞，在低倍镜下，细胞质中可见强度不一的颗粒状橙色量子点荧光。通过参考此处所示的20倍光学显微镜图像，可识别并利用透射电子显微镜（TEM）对光学显微镜选定的感兴趣区域（ROI）进行成像。

在更高倍数下观察，细胞显示出明亮的荧光，且胞质颗粒中量子点标记强烈。如本示例所示，将荧光数据叠加到透射电镜图像上，表明强阳性标记对应于囊泡限界膜内含有中等电子密度物质的颗粒。最后，如本例高倍放大图像所示，这些中等电子密度颗粒表现出强烈的量子点纳米晶体免疫标记。

一旦掌握，该技术若操作得当，可在八小时内完成。在进行该操作时，务必记住要小心处理载网，仅能触碰其边缘。在拾取载网时若触碰到切片，可能导致切片从载网上脱落。

完成此操作后，可进一步采用其他方法（如多重免疫标记）来回答更多问题，例如您感兴趣的蛋白质是否与另一种蛋白质共定位。该技术建立后，为病理学领域的研究人员探索存档人体组织中蛋白质定位提供了途径，并可用于透射电子显微镜的样品处理。观看本视频后，您应能够充分理解如何将荧光光学显微镜获得的免疫细胞化学信息与透射电子显微镜提供的超微结构信息相结合。

请注意，使用四氧化锇可能具有极高危险性，进行本实验操作时应采取预防措施，例如佩戴防护装备、在通风橱中操作以及妥善处理废弃物。