优化划痕损伤实验以检测可溶性香烟烟雾提取物损伤后小鼠间充质基质细胞迁移能力的变化

本实验的总体目标是检测可溶性香烟烟雾提取物造成损伤后，肺间充质基质细胞迁移能力的变化。该方法可用于解答肺再生生物学领域中的关键问题，例如如何改善肺前体细胞的迁移能力以促进肺组织修复。该技术的主要优势在于，它经过优化，可在实现更佳细胞迁移定量测量的同时，保持操作的经济性和易于定制化的特点。

在本实验中，将采用划痕实验来定量评估小鼠肺间充质基质细胞（MSCs）的迁移能力。在暴露于可溶性香烟烟雾提取物后，将MSCs接种于60毫米培养皿中，在完全培养基中培养，并按照方案文本所述进行划痕处理。适当的细胞汇合度对于划痕实验至关重要，因为它可确保成像软件准确识别划痕的边界。

此示例显示了在无菌环境下适合进行划痕处理的、达到95%融合度的间充质干细胞（MSCs）。取下受损MSC培养板的盖子，将直边工具（如已灭菌的塑料直尺）放置在培养板顶部边缘。使用直边工具可尽量减少后续将培养板置于显微镜载物台上成像时所需的旋转调整次数。

不移除培养基，使用无菌的200微升枪头，沿无菌直边在培养皿上划出四条平行划痕，划痕间距约5毫米，长度约50毫米。在60毫米培养皿上产生多条划痕不会改变间充质干细胞（MSCs）迁移所需的微环境，但其他细胞类型可能需要考虑此因素。用移液器吸除培养基，并用2毫升预热的完全培养基轻轻洗涤培养皿。

这可以防止细胞黏附到划痕的中心区域，并清除因划痕而松动的细胞。使用无菌永久性标记笔，向其中加入四毫升新鲜的完全培养基，并在培养板底部从一到四对每个划痕进行标记，标记位置应避免干扰成像。必须拍摄每个划痕的初始图像，因为在迁移前后必须对同一划痕的图像进行比较，因为划痕宽度可能存在差异。

如果在多个培养板上进行划痕实验，建议在对下一个培养板进行划痕前，先获取同一培养板上所有划痕的初始图像。使用配备相机的倒置相差显微镜采集分析所需的图像。将培养板置于显微镜载物台上，使用低倍物镜定位划痕。

第一，必须确保划痕在屏幕上完全水平，并且在视野中心保持完全水平，获取足够数量的图像以涵盖划痕长度的90%。从划痕的不同区域获取图像，图像之间不得有重叠。

不要采集划痕区域最前和最后5%长度范围内的图像，因为培养皿边缘的光线折射会使图像过度曝光，导致无法分析。将第一个划痕的图像保存在一个文件夹中。以相同方式获取第二、第三和第四个划痕的图像，并将每个划痕的图像分别保存在独立的文件夹中。

初次成像后立即将培养板放回培养箱。在开始此检测前，让细胞迁移 4 至 7 小时。下载 Image J 软件并安装伤口愈合工具插件。

在 ImageJ 中打开图像文件，然后点击“Process”（处理），选择“Find Edges”（查找边缘），以突出显示划痕周围用于伤口愈合分析工具的细胞。为计算划痕区域，点击“Image”（图像）→“Adjust”（调整）→“Color Threshold”（颜色阈值），在“Color Threshold”（颜色阈值）菜单中，将标记为“Threshold Color”（阈值颜色）的下拉菜单中的值更改为 BNW。将底部滑块完全向右移动，使图像完全变为黑色，然后调节顶部滑块，以在划痕区域与细胞前沿之间产生最大对比度。

缓慢地将上方亮度滑块从左向右调节，直至图像清晰显示划痕的轮廓。一旦识别出划痕的边缘，点击“更多工具”。在图像 J 工具栏中，从下拉菜单选择 MRI 伤口愈合工具，然后按下 M 键以高亮划痕区域，并输出计算得到的面积。

在结果弹出窗口中，将结果窗口中的所有数值复制并粘贴到 Excel 电子表格中。确保将不同划痕区域的数据分开。待细胞迁移 4 至 7 小时后，按照划痕时的相同顺序对各孔板进行显微成像，重复图像采集步骤，以确保每块孔板上的细胞具有相同的迁移时间。

可根据细胞对温度和pH变化的敏感性，在多个时间点进行成像。最终划痕图像的分析方法与初始划痕图像相同，均使用Image J进行。也可通过计算划痕面积来定量分析细胞迁移能力，正确。

融合度对于划痕实验的成功至关重要。此处展示的是在95%融合度下成功划痕的小鼠肺部间充质干细胞。相比之下，70%的融合度过低，无法实现成功的划痕，可能产生假性边界。

这些是成像软件定义的迁移前和迁移后具有相应划痕区域边界的代表性原始图像。这些图表显示了在95%融合度的小鼠肺部间充质干细胞培养板上制作的四条划痕中，每条划痕在迁移前后计算得到的平均划痕面积（以像素为单位），细胞分别暴露于0%或4%香烟烟雾提取物。对计算所得的划痕面积平均变化进行比较后发现，暴露于4%香烟烟雾提取物后，小鼠肺部间充质干细胞的迁移减少。

在进行该操作时，重要的是要记住针对我们所使用的特定细胞类型优化并仔细监测细胞汇合度，同时练习划痕操作以确保划痕尽可能均匀一致。完成该操作后，可进一步采用免疫组织化学等其他技术，以探究可能影响细胞迁移的蛋白表达变化及其他相关问题。