优化平行分段流动柱并实现多重检测

本高效液相色谱（HPLC）方法的总体目标是优化并行分段流动色谱柱，以实现多重检测。该方法可解答健康与福祉、环境科学、法医学以及需要对复杂样品（如生物发现）进行分析的其他领域中的关键问题。该技术能够在对样品进行全面分析的同时，提供有关复杂混合物中物质化学性质和生物活性的信息。

多种检测方案还能够实现快速分析。该方法有助于建立定义复杂混合物（如咖啡和葡萄酒）化学指纹的策略，使制造商能够区分其产品与廉价的假冒品种。最初，人们可能会觉得不将整个样品送入单一检测器进行准确分析的做法有违常规。

然而，每个流路中的分析物浓度高于常规色谱柱的总流路。首先，使用100%超纯水和纯甲醇分别作为流动相A和B，设置HPLC仪器。如果使用质谱检测器，则在两种流动相中各加入0.1%的甲酸，然后根据制造商的说明对HPLC泵进行 purge 操作。

按照制造商的说明，组装 MS、UV、VS 和 DPPH 检测器。确保各组件排列合理，使检测器管路中的死体积最小化。

然后将紫外VISTA检测器的波长设置为适用于本样品的特定波长，质谱检测器使用280纳米。采用正离子模式，结合全扫描检测方法进行总离子流图（TIC）分析。

将质谱检测器的温度和气体流速平衡至以下数值：汽化器温度为500摄氏度，毛细管温度为350摄氏度，辅助气体流速为40单位，清扫气体流速为5单位，鞘气流速为60单位，喷雾电压为3.5千伏。配制DPPH自由基试剂时，首先在容量瓶中将25毫克DPPH自由基溶于250毫升甲醇中。

向溶液中加入 250 微升甲酸，并将溶液超声处理 10 分钟。然后用锡箔覆盖烧瓶以避免光照。接下来，按照制造商建议，用 DPPH 自由基溶液冲洗泵，以建立 DPPH 自由基检测系统。

确保泵管连接至T形接头的入口，然后将100微升反应圈连接至T形接头的出口。将检测器连接至反应圈ENC外壳的另一端、反应圈以及柱加热器。最后将DPPH自由基紫外可见检测器设置为520纳米。

构建平行分段流（PSF）色谱柱时，首先将色谱柱入口连接至高效液相色谱（HPLC）仪器。接着，使用一段管路将中心端口连接至质谱（MS）检测器。再使用相同规格的管路将一个外周色谱柱端口连接至紫外-可见光（UV VS）检测器，另一个外周端口连接至DPPH自由基检测系统的T型接头。

使用柱端堵头封闭任何未使用的外周端口。将高效液相色谱的流速调节至每分钟1毫升，流动相B为100%，适用于内径4.6毫米、长度250毫米的色谱柱。平衡20分钟。

开始调节PSF系统时，首先将收集容器清空。使用这些小瓶分别从紫外VS和DPPH自由基端口收集流动相。记录收集的时间段，并确保每个容器中至少收集500毫克溶剂。

接下来，称量收集容器以确定流动相的质量，并将质量除以甲醇的密度，从而计算从每个出口收集到的流动相体积。最后，确定进入质谱检测器的流速，并根据文本方案中所述，将所有检测器的流速比例计算为总流速的百分比。如果流速比例与理想值存在显著偏差，则在必要位置增加额外的管路以调节背压，并重复收集和计算过程。

最后，调节DPPH自由基试剂泵的流速，使其与连接至检测器的出口端口的流速相匹配。对一份咖啡样品进行了多通道HPLC分析。能够同时记录DPPH自由基的紫外光谱（UV）和质谱（MS）色谱图，从而可将样品中对DPPH自由基呈阳性响应的化合物轻松对应至紫外色谱图。

根据保留时间对齐的质谱响应，当MSS总离子流（TIC）检测器出现阳性响应时，记录该峰的分子质量。不同检测方法之间峰的匹配简便，使得对于咖啡等复杂样品的筛选和表征更加迅速和高效。掌握该技术后，可在约一小时内完成方法建立并准备进行样品分析。按照此方案，还可使用其他检测器，如折光指数检测器、荧光检测器，以及基于化学反应的检测方法（如化学发光检测），以获得更多的样品信息。

观看本视频后，您应能认识到多重检测技术在深入理解复杂样本方面的重要性。此外，利用平行分段流通道进行多重检测是开展生物探索的一种极为高效的方法。