使用反应流高效液相色谱柱进行柱后衍生化

本方法的总体目标是通过使用反应流路柱，提高高效液相色谱柱后衍生化（PCD）方法的效率和灵敏度。该方法有助于解决药物学、生物医学和环境科学等领域中的关键问题，特别是在分析对HPLC检测器响应信号较弱的化合物时具有重要意义。该技术的主要优势在于无需使用反应盘管。

由于柱洗脱液与衍生化试剂的混合效率高于传统方法，该方法已用于研究抗氧化剂、氨基酸和酚类物质，还可应用于其他类别化合物，如硫醇、金属、抗生素和毒素。

尽管整个样品未经过衍生化处理，但由于谱带展宽较小，流出液流中分析物的浓度高于常规柱后衍生化分析。开始此操作前，将高效液相色谱仪的A通道设置为100%水，B通道设置为100%甲醇作为流动相，并根据制造商的要求对泵进行 purge。安装高效液相色谱仪的组件以及额外的衍生化泵。

随后，将紫外/可见光检测器设置为在 520 纳米波长下进行分析。将反应流（RF）柱的入口连接至高效液相色谱仪。使用一段长度为 15 厘米、内径为 0.13 毫米的管路，将出口侧端口连接至紫外/可见光检测器。

接下来，将DPPH泵管连接至RF柱出口的一个侧端口。使用柱塞堵住RF柱出口上未使用的侧端口。将一段15厘米长、内径为0.13毫米的管路连接至RF柱出口的中心端口。

将高效液相色谱泵的流速调节至1 mm/min，使用100%甲醇。然后用100%甲醇平衡色谱柱10分钟。此时，配制浓度为0.1 mg/mL的DPPH甲醇溶液。

将含有DPPH试剂的烧瓶超声处理10分钟。根据制造商的要求，用配制好的DPPH试剂冲洗DPPH泵。随后，取两个干燥且洁净的容器，分别标记为“中央”和“外周”，并准确称量这两个容器的质量。

将从中心端口流出的流出液收集到标记为“中心”的容器中，持续一分钟。重新称量中心端口容器后，计算来自中心端口的流体重量。对从RF柱外周端口连接的紫外/可见光检测器（UV/VIS）流出的流出液，重复上述步骤。

计算外周端口血管的权重。接着，计算来自中心端口和外周端口的血流所占的百分比。重复上述步骤直至流量比例正确，然后将DPPH泵的流速设定为0.5毫升每分钟。

运行结束后，停止衍生化试剂泵的流速。将DPPH试剂泵管路从侧端口移开，并用封帽封闭该端口。用色谱柱储存所需的流动相平衡色谱柱，使流动相以每分钟一毫升的流速通过色谱柱，持续10分钟。

然后，停止HPLC仪器上气泡相泵的流动。最后，将DPPH试剂替换为甲醇，并冲洗辅助泵。此处展示了使用传统PCD和RF-PCD仪器对一份浓缩咖啡样品进行DPPH自由基衍生化后的两个色谱图。

此处列出了在RF-PCD和常规PCD模式下分析的每种氨基酸的定量限和检出限。此处展示了使用常规PCD方法、RF-PCD方法以及RF-PCD方法中未衍生化流路分析四种氨基酸的色谱图。此处展示了使用常规PCD和RF-PCD两种方法测得的甘氨酸和亮氨酸峰信号的比较结果。

此处展示了使用传统PCD方法、RF-PCD方法以及RF-PCD方法中未经衍生化的流路分析色氨酸峰时峰宽的比较。一个包含21种组分的测试样品被用于实验，其中部分组分对衍生化反应有响应，部分则无响应；该样品经过分离、衍生化和检测。同时，相同混合物也在未经衍生化的条件下进行分离和检测，以作比较。

此处展示了对甲酚在使用 RF-PCD 柱衍生化和未衍生化条件下峰形的比较。一旦掌握，该技术的建立时间可与传统的柱后衍生化分析相当。在执行此操作时，重要的是要尽可能接近规定的流速比例。

采用此方法后，可使用其他柱后衍生化试剂（如邻苯二甲醛、茚三酮或卤素）来分析其他化合物。观看本视频后，您应能充分了解如何安装和优化反应流柱。