使用流通式微反应器快速酶解蛋白质以进行质谱检测

本方案的总体目标是描述一种用于快速酶解蛋白质的流通式胰蛋白酶微反应器的制备方法，从而实现通过电喷雾电离质谱仪进行蛋白质鉴定。该方法有助于阐明分离纯化后蛋白质的氨基酸序列，以支持对其结构与功能的后续表征。本方案的主要优势在于操作快速、成本低廉，并且易于整合到采用微加工平台的工作流程中。

首先，使用玻璃毛细管切割器将较粗的玻璃毛细管切割至7到8厘米的长度，将较细的毛细管切割至3到5厘米的长度。使用显微镜检查，确保两根毛细管的端面均整齐、平直，无任何突出的毛刺。将较细的毛细管一端插入较粗毛细管的一端，插入深度约为6毫米。

然后，使用棉签将少量胶水涂抹在毛细管连接处周围，并在室温下静置过夜使胶水固化。接着，将插入的毛细管切割至约10至15毫米的长度。此端将作为电喷雾电离发射器。

将较大直径毛细管的另一端插入一段预先切好的、长度为4至5厘米的1/32英寸PEEK管中，并将其连接至一个PEEK接头。然后，将一段5厘米长的1/16英寸PTFE管插入该接头的另一端并拧紧。在一支洁净干燥的2毫升玻璃样品瓶中，称取4毫克C18颗粒，随后加入0.5毫升异丙醇。

盖上瓶盖，将其放入超声波清洗器中，进行超声处理，使颗粒在溶液中均匀分散。接着，使用250微升注射器吸取200微升C18悬浊液。

将注射器插入1/16英寸的PTFE管中，并缓慢将浆料注入大口径毛细管内。在显微镜下观察毛细管中颗粒的填充过程，直至形成2至3毫米的颗粒填充段。较小的毛细管通过楔形效应将这些颗粒保留在微反应器中。

最后，用50微升水与乙腈按50:50配制的溶液冲洗微反应器，随后用50微升含有49微升水和1微升乙腈的溶液冲洗。将毛细管微反应器从PEEK接头断开，并连接至PEEK-T接头。然后，插入一根长2厘米的铂丝，铂丝外包裹1/32英寸的PEEK套管以实现绝缘，并确保与PEEK-T接头侧臂之间无泄漏的连接。

将一根半米长的样品传输毛细管连接到PEEK-T的另一端。使用1/32英寸的PEEK套管以确保连接处无泄漏。将PEEK-T固定在XYZ平台上。

将电喷雾电离发射器置于距离质谱仪进样毛细管约两毫米的位置。然后，将铂丝连接到质谱仪的电喷雾电离电源。同时，使用1/16英寸PEEK套管将样品传输毛细管的另一端连接至不锈钢接头，以确保无泄漏连接。

接下来，将一段长约4至5厘米、1/16英寸的PTFE管连接到不锈钢接头的另一端。按照随附文本方案中的描述，在控制质谱仪的软件包中输入串联质谱的数据采集参数。将这些参数保存为方法文件，以完成分析前的准备工作。

LTQ 质谱系统配备了一个经过改装的电喷雾电离（ESI）源，其中包含一个自制的 XYZ 位移台，可实现质谱仪与多种样品输入方式的联用。用含有2%乙腈的50毫摩尔碳酸氢盐水溶液填充一支250微升的注射器。然后将注射器连接至微反应器，并将其置于注射泵下方。

用微反应器以每分钟2 µL的流速冲洗5分钟，以准备进行分析。然后，将目标蛋白质样品加入250 µL的注射器中，并以每分钟2 µL的流速注入样品溶液，持续5分钟。接着，将装有5 µM胰蛋白酶溶液的250 µL注射器置于注射泵下，以每分钟2 µL的流速在微反应器上已吸附的蛋白质上孵育1至3分钟。

每次实验前必须新鲜解冻并配制胰蛋白酶溶液，以确保该蛋白水解酶保持其活性以及微反应器的工作 pH 值，即约 pH 8。另取一支 250 微升注射器，装入由 0.1% 三氟乙酸加入 2% 乙腈水溶液组成的溶液。

使用该溶液以每分钟2微升的速度冲洗微反应器5分钟，以终止蛋白酶消化过程。然后切换至装有含0.1%三氟乙酸的50%乙腈溶液的注射器，并将电喷雾电离电压调至约2000伏，启动质谱数据采集过程。使用酸化溶液以每分钟300纳升的速度从微反应器中洗脱蛋白质消化产物，持续20至30分钟。

使用随附文本方案中提供的数据采集参数获取质谱数据。通过首先将原始数据上传至搜索引擎，使用最小冗余的蛋白质数据库处理LTQ MS原始文件。然后，将母离子和碎片离子质量容差分别设置为2道尔顿和1道尔顿，并在搜索中仅使用完全由胰蛋白酶切割产生的肽段，允许最多两个漏切位点。

此外，将高置信度和中等置信度的错误发现率分别设置为 1% 和 3%，除非特别针对特定修饰进行检测，否则不启用翻译后修饰选项。最后，对数据进行过滤，仅保留高置信度的肽段匹配结果。图中所示为一个质谱图，该谱图由经微反应器中蛋白水解处理后的蛋白质混合物所产生的胰蛋白酶肽段组成。

这些标签代表了最强的胰蛋白酶肽离子，并提供了其序列和相应的蛋白质标识符。该微反应器提供了一种易于实施的实验设置，可用于进行蛋白质的酶解消化，并能在30分钟内完成质谱分析与鉴定。在进行该操作时，必须注意保持与溶液接触的小瓶和仪器的清洁，这对于避免样品污染至关重要。

采用该方法后，可结合其他质谱数据采集方法，以更全面地表征生成的肽段，并进一步探究蛋白质结构相关的问题。该技术的建立为蛋白质组学领域的研究人员提供了新的途径，使其能够开发出更快速的蛋白质分析方案，并推动新型微裂解平台的发展，从而实现对生物样本的高通量分析。该技术的局限性在于仅适用于分析较为简单的蛋白质混合物，此类混合物通常产生 25 至 50 个肽段。

这些肽可通过简单的进样实验进行分析，无需在质谱分析前进行液相色谱分离。请注意，使用有机溶剂可能具有极高危险性，在执行本操作时应始终采取预防措施，例如避免明火。