利用数字条形码平台对感染微生物进行基因表达谱分析

本实验的总体目标是准确测量病原体在体内的基因表达，以揭示病原体如何适应感染环境并对其宿主造成损害。该技术为传染病领域的研究人员探索病原体在真实感染过程中于不同类型组织及多个时间点的基因表达动态奠定了基础。该方法的主要优势在于其高度敏感性和极强的可重复性。

该方法使得从真实感染中获取的微量组织样本中定量病原体基因表达成为可能。开始准备试剂时，将2-巯基乙醇加入RLT缓冲液中并充分混匀。配制25:24:1的苯酚-氯仿-异戊醇溶液混合物。

标记M型均质管并置于冰上预冷。标记两个2毫升螺旋盖管，每管中加入约300微升氧化锆珠。准备好以下仪器以备使用，包括组织解离仪、珠磨机、配有50毫升离心管和96孔板转子的台式离心机以及分光光度计。

从-80摄氏度冰箱中取出之前冻存的、从小鼠体内分离的白色念珠菌感染肾脏，置于冰上。向每份肾脏中加入1.2毫升RLT缓冲液。然后将每份肾脏连同缓冲液转移至M型匀浆管中。

RLT 缓冲液的使用量需通过经验确定。RLT 缓冲液过多会稀释样品浓度，而过少则会使匀浆液变得非常黏稠，极难操作。接下来，使用组织解离仪并设置为预设程序 RNA 2.01，对肾脏进行匀浆处理。

然后，在 1000 × g 条件下离心 1 分钟。将每份匀浆液中的 600 微升转移至含有氧化锆珠的螺旋盖管中，并将剩余匀浆液置于冰上保存。向每根管中加入 600 微升苯酚-氯仿-异戊醇， tightly 关闭管盖，并在 4 摄氏度下使用珠磨机涡旋振荡 3 分钟。

在4°C条件下，以15,000 G离心5分钟。小心将水相转移至新的1.5毫升微量离心管中，加入等体积的70%乙醇。然后将样品加载到离心柱上，以8,000 × G离心。用700微升RW缓冲液洗涤每个离心柱一次，随后用500微升RPE缓冲液洗涤两次。

将离心柱转移至干燥的收集管中，再离心一分钟以去除任何残留液体。最后，用 50 µL 水洗脱 RNA。然后使用分光光度计在 OD 216 nm 下测量 RNA 浓度。

为了使用数字条形码技术进行基因表达谱分析，首先将报告编码集和捕获编码集在冰上解冻。向报告编码集中加入130微升杂交缓冲液，轻轻翻转混匀后离心。

接下来，将20微升混合液加入到12个反应管中的每一个。然后向每管加入10微克的组织总RNA，并通过移液混匀。根据感染模型、接种量以及所用病原体菌株的不同，病原体RNA在总RNA中的比例可从0至2%不等。因此，每管所需添加的总RNA量应通过实验经验进行优化。

现在向每支试管中加入五微升捕获探针组。通过翻转试管混匀，并迅速离心。然后将反应体系置于带有加热盖的PCR仪中，在65摄氏度孵育约18小时。

从20摄氏度环境中取出一个样本卡盒，使其升至室温。从4摄氏度环境中取出两个试剂板，在台式离心机中以670 × g离心2分钟。接下来，按照屏幕上的逐步说明设置预处理工作站，并选择高灵敏度选项。

然后从热循环仪中取出反应管，立即加载到制备仪上。运行三小时的高灵敏度程序后，取出 cartridge，并用透明胶带密封各通道。如有需要，可在 cartridge 底部加入矿物油。

然后将试剂盒装载到数字分析仪上。根据屏幕上的分步说明设置数字分析仪，并选择高分辨率扫描选项。运行扫描程序后，下载结果或选择通过电子邮件接收结果，并将原始数据导入制造商提供的软件中。

根据文本方案分析数据。本视频中展示的方案具有独特优势，即同时使用捕获探针和报告探针，以提高特异性并降低宿主RNA带来的背景噪音。如图所示，未感染组织样本的背景原始计数均低于10，而两个感染组织样本的原始计数均高于10。

两个生物学样本的原始计数具有非常好的相关性，R平方值为0.945。该平台还提供了足够的动态范围，能够涵盖天然的生物学表达水平。利用一组针对248个环境响应基因的探针，确定了病原体基因表达的两个阶段。

早期基因表达反应包含在接种物与感染后12小时样本之间RNA水平存在显著差异的基因。还发现了一种晚期基因表达反应，包含在感染后12小时与48小时样本之间RNA水平存在显著差异的基因。这些结果表明，白色念珠菌（C.albicans）的基因表达在侵袭性感染哺乳动物宿主过程中受到动态调控。

该方法简便快速，从组织采集到获得表达数据的整个流程耗时不到48小时。对12个样本进行操作的实际工作时间约为4小时。

尽管该方法旨在捕获病原体在体内的基因表达，但同样可用于分析宿主基因表达。因此，研究人员可同时获得感染过程中宿主和病原体两方面的有用信息。