一种便捷的儿茶酚胺类神经递质及其代谢物的提取与高效液相色谱分析方法

本实验的总体目标是通过简便的固相萃取结合高效液相色谱-电化学检测法，同时测定婴儿尿液中的三种单胺类神经递质及其两种代谢产物。该方法可在短时间内通过简单操作，对完整样品中的不稳定目标化合物进行预测和测定。样品可通过填充细纤维的固相萃取小柱进行快速前处理净化，样品中的待测物可被有效富集、溶解，并在电化学检测系统上进行检测。

我们最初想到这一方法，是因为意识到儿茶酚胺类神经递质在生物体液中的提取与分析对于评估机体应激功能及相关疾病至关重要。由于操作过程中必须避免光照，且前处理时间应尽可能短，因此初次接触该方法的研究人员可能会遇到困难。本次实验操作由本实验室的两位博士研究生魏兰兰和Qing Han进行示范。

首先，通过将2毫克化合物溶解于1毫升蒸馏水中，配制浓度为2毫克/毫升的DPBA储备液。将溶液置于4摄氏度避光保存。在配制分析物扩增子时，需注意儿茶酚胺的化学结构和性质不稳定，容易分解，因此扩增子的制备过程必须迅速，并避免暴露于微弱阳光下。

分别称取1.0毫克去甲肾上腺素、肾上腺素、多巴胺、MHPG、DOPAC以及内标物DHBA，置于不同的1.5毫升微量离心管中。除肾上腺素外，其余各化合物均加入1.0毫升蒸馏水溶解；肾上腺素则应溶于0.01摩尔/升盐酸溶液中。将配制好的标准品在避光条件下高速振荡，直至各分析物完全溶解。

这些是初级标准品溶液，可在零下20摄氏度保存数周。为配制去甲肾上腺素、肾上腺素、多巴胺、DOPAC和MHPG的次级分析物标准品溶液，分别取5微升每种初级分析物标准品溶液，加入装有4,975微升去离子水的5毫升离心管中。这些溶液需每日新鲜配制，并避光保存于4摄氏度，直至使用。

对于DHBA，取5微升初级储备液加入5毫升离心管中的4,995微升蒸馏水中，混匀后于4摄氏度避光单独保存。使用次级分析物储备液进一步稀释，以制备标准曲线。溶液需避光保存于4摄氏度，并每日新鲜配制。

接下来，使用适当浓度的标准储备液测试ECD检测器的最佳电压。调节电压，找到使分析物色谱峰形最佳的电压值。配制10毫升洗脱溶剂时，先量取5.5毫升蒸馏水，然后加入1.5毫升乙腈，并逐滴加入3毫升磷酸至水中。

配制流动相时，将文本方案中列出的组分量取至一个洁净的1升瓶中。加入40毫升乙腈和蒸馏水至1,000毫升。振摇并超声振荡15分钟，直至溶液中的物质完全溶解。

使用带有玻璃电极的pH计，用饱和氢氧化钠溶液将流动相的pH值调节至4.21。使用0.45微米的聚偏二氟乙烯微孔膜和真空抽滤装置过滤流动相，以去除杂质。每次使用前，采用超声振荡脱气15分钟。

然后，将尿液样本在室温下涡旋并以 1,510 × g 离心 10 分钟，以去除大部分颗粒物干扰。收集上清液，弃去沉淀物用于后续实验。为了有效提取待测物，在离心后应立即进行填充纤维固相萃取（PFSPE）前处理。

为活化纳米纤维，使用5毫升注射器将100微升甲醇和100微升水依次缓慢逐滴通过PFSPE柱。尿液样品必须与DPPA溶液混合，以提高其疏水性，促进儿茶酚胺及其代谢物在纤维上的吸附。同时需加入DHBA溶液作为内标物。

在0.5毫升离心管中，将100微升尿液样本与100微升浓度为2毫克/毫升的DPBA溶液以及30微升浓度为100纳克/毫升的DHBA内标溶液混合。然后使用5毫升气压式塑料注射器，借助气压将混合后的样品溶液压过PFSPE柱。使用5毫升气压式塑料注射器向固相萃取柱中加入100微升DPBA溶液，通过气压缓慢推动溶液流过柱体，重复此步骤三次以洗涤柱子。

此洗涤步骤是必要的，因为DPBA溶液可去除杂质，同时保留待测物，从而提高对待测物的灵敏度和选择性。接下来，将50 µL洗脱液上样至PFSPE柱，推动液体通过色谱柱，并用0.5 mL离心管收集洗脱液。开启高效液相色谱脱气机，以去除系统中的空气。

在进行样品分析之前，系统应使用流动相运行超过0.5小时，以达到平衡并降低基线噪声。使用自动进样器吸取20微升洗脱液，然后将其注入高效液相色谱电化学检测（HPLC ECD）系统。运行结束后，通过检测器界面关闭检测池。

请勿通过检测器背面的开关关闭设备，否则可能损坏仪器。手动将流动相组成调整为10%甲醇和90%水。运行至少30分钟后，手动将流动相更换为HPLC级甲醇。

运行系统约15分钟，以甲醇保护系统。若未按照推荐的运行时间执行此步骤，可能导致色谱柱和检测器损坏。关闭流速，然后关闭脱气机。

按照文中的实验方案进行儿茶酚胺分析。图中显示了添加目标物和内标物的水样在未经萃取情况下的色谱图。在本方案所述的高效液相色谱条件下，PFSPE 方法的五个目标峰均得到良好分离，且峰高显著高于商用苯硼酸柱萃取所得结果。

此外，DOPAC 峰未在 PBA 小柱的提取结果中出现，表明 PBA 柱无法有效提取 DOPAC。在对尿液样本进行提取时，PFSPE 方法不仅能够良好地提取目标物并实现清晰的色谱峰识别，还能去除尿液中的大部分干扰物质。通过绘制各化合物的峰面积比值曲线构建校准曲线，显示出在低浓度下具有良好的线性关系。

为验证真实尿液样本，检测了28例高危婴儿和22例健康婴儿的尿液样本。尽管某些儿茶酚胺在高危组与健康组之间无显著差异，但高危婴儿的MHPG代谢物含量高于对照组。因此，尿液中MHPG的水平可能是早期识别高危婴儿的潜在标志物。

一旦掌握，该技术可在数分钟内完成。在操作过程中，务必记住要新鲜制备灰烬，快速操作，并避免暴露于直射阳光下。在吸收和洗涤步骤中，二苯基硼酸溶液的添加也十分关键。

采用该方法后，由于缺乏对血浆或脑脊液中儿茶酚胺及其代谢物终止的检测手段，因此尚存局限性。此外，还可通过该方法测定本方案在检测其他生物体液时的普适性。该技术建立后，为研究人员探索儿童样本中尿液儿茶酚胺水平与神经发育缺陷之间的关系奠定了基础。

观看本视频后，您应能够充分理解如何使用带有毛发样本和简易装置的固相萃取方法；PCE PS空气纤维素协同废物DPBA可用于清除尿液样本中的儿茶酚胺类神经递质。该技术有助于对存在脑损伤风险的婴儿进行早期诊断。因为比较分析显示自闭症儿童的单胺代谢产物MHPG存在异常差异，提示儿茶酚胺代谢物可能是重要的候选生物标志物。