利用微波辐射构建骨架环状肽库作为潜在抗寄生虫治疗药物

本实验的总体目标是利用微波辐射技术，构建具有构象多样性的靶向骨架环化肽模拟物文库，用于开发新型抗寄生虫治疗药物。该方法有助于开发可特异性靶向蛋白质-蛋白质相互作用的新型工具。开始实验时，向聚丙烯柱中加入2.5毫升目标氨基酸、1毫升活化剂和0.5毫升活化剂碱液。

将反应柱放入自动微波合成仪中，在25瓦、75摄氏度条件下进行偶联反应，持续300秒。反应完成后，在室温下用7毫升N,N-二甲基甲酰胺（DMF）清洗树脂120秒。重复上述步骤五次后，向聚丙烯反应柱中加入7毫升含20%哌啶和0.1摩尔1-羟基苯并三唑（HOBt）的DMF溶液，在45瓦、75摄氏度条件下孵育30秒。

完成后，排干反应混合物。接着，向聚丙烯柱中加入7毫升含0.1摩尔HOBt的20%哌啶DMF溶液，在45瓦、75摄氏度条件下孵育180秒。排干反应混合物后，用7毫升DMF在室温下洗涤树脂120秒。

然后，在室温下用 7 毫升二氯甲烷（DCM）洗涤树脂，持续 120 秒。进行酸酐偶联时，在室温下用 7 毫升 1-甲基-2-吡咯烷酮（NMP）洗涤树脂，持续 120 秒。完成后，排空反应混合物。

重复上一步骤三次后，在50毫升聚丙烯管中，将10当量的相应酸酐溶于5毫升NMP中。然后向溶液中加入1当量的4-二甲氨基吡啶（DMAP）和10当量的N,N-二异丙基乙胺（DIEA）。将该混合物加入树脂中，在25瓦、75摄氏度条件下孵育300秒。

用NMP洗涤树脂后，在室温下用7毫升DMF洗涤120秒。此时，将树脂转移至配备有帽塞和活塞的聚丙烯柱中。树脂用DCM洗涤后，每1克树脂加入15至25毫升由1%三氟乙酸、5%三异丙基硅烷和94%DCM组成的混合液。

将聚丙烯柱置于摇床上，室温下振荡五分钟。随后通过施加真空负压，从聚丙烯柱中排空溶液。重复上述步骤三次后，用七毫升二氯甲烷（DCM）在室温下洗涤树脂120秒。

这些步骤极为重要，因为在二氯甲烷-三氟乙酸溶液中，多种树脂上的三苯甲基保护基团被发现会部分断裂。去除甲基三苯甲基基团是一个缓慢的过程，需要多次洗涤。在50毫升聚丙烯管中，将五当量的苯并三唑-1-基氧基三吡咯烷基磷六氟磷酸盐溶解于5毫升二溴甲烷中。

然后，向溶液中加入10当量的DIEA。将混合物加入经DCM冲洗的树脂中，在25瓦、75摄氏度条件下孵育300秒。随后，在室温下用7毫升DCM洗涤树脂120秒。

用二氯甲烷洗涤两次后，将树脂转移至聚丙烯柱中，并用二乙醚洗涤两次。将树脂置于室温下含有氢氧化钾的真空干燥器中干燥至少三小时。随后，每1克树脂加入10毫升预冷的三氟乙酸裂解液。

将聚丙烯柱置于摇床上，室温下振荡3小时。随后，通过将树脂过滤至50毫升聚丙烯管中收集裂解液。向管中加入35毫升冷的乙醚。

在4°C条件下，以1,207 ×g离心5分钟。然后，倾去醚层。进行凯撒试验时，通过将16.5毫克氰化钾溶解于25毫升蒸馏水中来配制溶液A。

取1毫升该溶液，用49毫升吡啶稀释。接着，通过将1克茚三酮溶解于20毫升乙醇中制备溶液B。通过将40克苯酚溶解于20毫升乙醇中制备溶液C。

溶液配制完成后，取少量树脂珠粒转移至试管中。向试管中加入每种溶液各三滴，并混匀。最后，将试管置于加热块上，在110摄氏度下加热5分钟。

骨架环肽的合成采用微波自动合成仪，在固相载体上按照FMOC和叔丁基保护策略进行。产物通过质谱分析，并采用高效液相色谱法（HPLC）测定其纯度。生物学筛选结果显示，肽pL1对杜氏利什曼原虫具有活性，该寄生虫可引起内脏利什曼病，是人类最严重的利什曼病类型。

与对照处理相比，多肽pL1使寄生虫存活率降低了75%。一旦掌握，该技术若操作得当，可在三到五天内完成。该技术建立后，为众多领域的研究人员探索多肽在基础研究和治疗中的药理调控作用铺平了道路。

观看本视频后，您应能充分理解如何构建具有构象多样性的拟肽化合物聚焦库，以特异性靶向蛋白质-蛋白质相互作用。请务必注意，三氟乙酸具有极高危险性，在操作过程中必须采取预防措施，例如佩戴护目镜、实验服和手套，并在通风良好的通风橱内进行实验。