利用连接臂上的硫鎓中心构建环状多肽

在本实验方案中，构建了一种锍盐，该锍盐可作为一种新型“手”，在特定邻近位置与蛋白质中的半胱氨酸发生反应。该技术的优势在于反应快速高效，且无需甲硫氨酸催化剂，从而开发出一种稳定肽的简单高效方法。首先，在500毫升烧杯或烧瓶中配制含有20%哌啶或50%吗啉的N端9-芴甲氧羰基（Fmoc）脱保护溶液，并用DMF溶解。

然后，向柱中加入10毫升去保护溶液，并通入氮气鼓泡30分钟，或分两次每次5分钟。用真空泵抽干溶液，再依次用二氯甲烷和N,N-二甲基甲酰胺各洗涤树脂五次。为检测树脂，取少量树脂加入1毫升N,N-二甲基甲酰胺，使其成为深黄色溶液，再向玻璃试管中加入200微升5%茚三酮溶液。

在130摄氏度下加热三分钟，以评估树脂颜色的变化。进行肽偶联时，在聚丙烯管中按文中所述配制混合溶液，并将其溶于3毫升N,N-二甲基甲酰胺中。然后，向溶液中加入173微升N,N-二异丙基乙胺或154微升N,N'-二异丙基碳二亚胺，以使氨基酸失活。

接下来，将混合物加入含有树脂的柱中，并用氮气鼓泡处理两小时。偶联反应完成后，取少量树脂加入一毫升 N, N-二甲基甲酰胺，再向玻璃试管中加入200微升5%茚三酮溶液。在130摄氏度下加热三分钟，若树脂变为无色，则表明在去保护步骤前已无游离氨基存在。

排干溶液后，按先前所示方法洗涤树脂，并向柱中加入 10 毫升去保护溶液。然后用氮气鼓泡 30 分钟，或分两次每次鼓泡 5 分钟。再次加入新鲜溶液。

向装有脱水树脂的柱中加入10毫升无水甲醇，并用氮气吹干，以备下次使用。称取100毫克树脂装入柱中，并在偶联步骤前用二氯甲烷和N,N-二甲基甲酰胺洗涤树脂。在100毫升烧杯或烧瓶中加入三氟乙酸、三异丙基硅烷和二氯甲烷的混合液，配制溶液以去除三苯甲基-L-半胱氨酸保护基团。

向柱中加入5至10毫升制备好的溶液，去除保护基团，反应10分钟。用氮气鼓泡重复此步骤六次，直至黄色完全消失。用真空泵抽干溶液后，按之前所示方法洗涤树脂。

然后，将二卤代连接剂和N,N-二异丙基乙胺加入50毫升烧杯或烧瓶中的N,N-二甲基甲酰胺内，配制用于与脱保护半胱氨酸反应的溶液。向柱中加入5至10毫升该反应溶液，通入氮气鼓泡，与保护的半胱氨酸反应至少三小时。再次使用真空泵将溶液抽干，并按照前述方法依次洗涤树脂。

在通风橱中，将三氟乙酸混合液加入一个20毫升的烧杯或烧瓶中，用于肽的环化反应。然后，取5至10毫升该混合液加入聚丙烯管中，在三氟乙酸混合液中裂解树脂，反应3小时。在偶联步骤之前，按照先前所述方法对树脂进行脱水和洗涤，随后配制1%的甲酸水溶液和1毫摩尔的丙炔基溴，并加入甲硫氨酸肽溶液中。

接下来，在室温下将甲硫氨酸与丙炔溴的偶联反应振荡反应12小时。反应结束后，将产物溶解于聚丙烯管中的乙腈中，并通过0.22微米滤膜过滤。然后立即采用反相高效液相色谱法纯化该溶液，并将其冷冻干燥成粉末，以供后续使用。

通过半胱氨酸与甲硫氨酸之间的双烷基化反应合成的环肽经HPLC和LCMS谱图表征，结果显示非对映异构体具有不同的保留时间但分子量相同。非对映异构体及其偶联产物的HPLC色谱图显示了环肽与其产物之间随时间依赖性的相互转化。通过LCMS测定采用硫醇-炔型反应合成的环肽的分子量，并通过HPLC对肽进行分离和纯化。

通过质子核磁共振（NMR）和异核单量子相干谱进一步表征了这些多肽，揭示了其化学位移。为探究由于锍环打开导致的多肽稳定性变化，获得了环状多肽与二硫苏糖醇及重水在时间依赖性转化过程中的质子核磁共振谱。结果显示，在24小时后未形成任何加成或开环产物。

该方法建立了一种合成环肽的有效策略。反应的选择性因形成稳定环化肽构象的结构而得到增强，表明环肽具有作为药物催化剂的良好前景。