一种快速高效地纯化由人胚胎干细胞分化而来的内胚层细胞的方法

本方法的总体目标是从人类胚胎干细胞（ES细胞）中纯化生成的内胚层细胞。该方法有助于回答干细胞领域中关于内胚层分化的关键问题。该技术的主要优势在于，去除未分化细胞后可获得纯度较高的内胚层细胞群体。

开始实验前，用基底膜基质对六孔细胞培养板进行包被，每孔加入1毫升，室温孵育至少30分钟。随后，用无菌玻璃巴斯德吸管吸去80%至90%融合度的人胚胎干细胞培养物中的培养基，以收集人胚胎干细胞。

每孔加入两毫升 PBS 清洗细胞。振荡培养板并吸去盐水，以去除死亡细胞和碎片。接着，在 37 摄氏度、5% 二氧化碳条件下，用一毫升无酶传代溶液试剂轻柔解离细胞团块，直至细胞明显分散成较小的团块为止。

约七分钟后，向孔中加入 1 毫升 DMMF12 培养基。使用 1 毫升移液枪头上下吹打数次，使残留的细胞团块解离为单细胞悬液。用同一支移液枪将细胞转移至离心管中，并用 1 毫升新鲜 DMMF12 培养基冲洗孔壁，将冲洗液一并收集至该离心管中。

离心收集细胞后，将沉淀重悬于5毫升添加ROCK抑制剂的ES细胞培养基中。计数细胞，并将每孔1.5×10⁵个细胞接种至包被有基底膜基质的培养板中，培养基中需补充ROCK抑制剂以防止细胞凋亡。将细胞培养约24小时。

然后使用无菌的玻璃巴斯德吸管，将每孔中的培养基更换为2毫升原始条带诱导培养基。再培养24小时后，将培养基更换为内胚层诱导培养基，继续培养48小时，期间每天更换培养基。在培养的最后一天，且至少在收获细胞前1小时，向培养基中加入新鲜的ROCK抑制剂。

然后使用无菌的玻璃巴斯德吸管从每个孔中吸出培养基，并用无酶传代溶液试剂解离细胞，操作方法如前所述。当获得单细胞悬液后，对细胞进行计数并离心。此后务必确保所有培养基和缓冲液中均含有ROCK抑制剂，以防止细胞死亡。

否则，在回缩后将无法正确附着。用 100 微升 PEB 缓冲液重悬沉淀，每 1 × 10⁷ 个细胞加入 ROCK 抑制剂。然后向细胞中加入 CXCR4 APC 抗体。

轻轻弹击管壁以混匀。在 4 摄氏度下孵育 15 分钟后，用一到两毫升 PEB 缓冲液洗涤细胞，并使用无菌玻璃巴斯德吸管吸除上清液。每 1 × 10⁷ 个细胞用 80 微升 PEB 缓冲液重悬沉淀，并向细胞中加入 20 微升抗 APC 磁珠。

轻轻弹动混匀样品。随后将细胞在 4°C 条件下孵育 15 分钟。孵育结束后，用 1 至 2 毫升添加了 ROCK 抑制剂的 PEB 缓冲液洗涤细胞。

将沉淀重悬于500微升新鲜PEB缓冲液（含抑制剂）中。通过磁珠分离法分离CXCR4+细胞时，将一个中等大小的磁性柱安装至合适尺寸的磁铁上，并用500微升PEB缓冲液（含ROCK抑制剂）预清洗柱子。当洗涤液完全从柱子顶部流尽后，将全部磁珠标记的细胞悬液上样至柱中，用锥形管收集穿流液。

用500微升含ROCK抑制剂的PEB缓冲液洗涤柱三次。然后将柱子从磁铁上转移至合适的收集管中。再将1毫升含ROCK抑制剂的PEB缓冲液快速通过柱子，以收集CXCR4+细胞。

可选择性地分别收集所有流穿样品，从每个样品中取 20 µL 等分试样，通过流式细胞术测定每个等分试样中 CXCR4+ 细胞的百分比。可对初次流穿的样品重复此步骤，以收集未与柱结合的细胞。然后合并所有分装的 CXCR4+ 样品并进行离心。

最后，将沉淀重悬于1毫升添加了ROCK抑制剂的内胚层诱导培养基中，并将细胞以适当的密度接种至包被有基底膜基质的细胞培养容器中。在分化之前，人胚胎干细胞高表达多能性标志物SOX2，而定型内胚层标志物FOXA2则未被检测到。

分化后，ES细胞在基因和蛋白质表达方面会发生显著变化。事实上，在分化培养基中培养四天后，许多原先的ES细胞核内会均匀地共表达SOX17和FOXA2，这是定型内胚层分化的典型特征。部分细胞则抵抗分化过程，不表达这两种标志蛋白中的任何一种。

事实上，这些细胞仍保持其多能性标志物 SOX2 的表达。在此代表性实验中，在分化第三天，收获的 ES 细胞中近 60% 表达 CXCR4，经磁珠分选去除多能性细胞及其他非目标谱系细胞后，其纯度提高至 85% 以上。接种纯化的 CXCR4+ 细胞后，仅检测到少量 SOX2+ 细胞，而绝大多数接种细胞表达 FOXA2。

一旦掌握，该技术若操作得当，可在两小时内完成。在此步骤之后，可进行其他类似实验，如免疫组织化学或定量 PCR，以进一步探究分化过程的相关问题。观看本视频后，您应能充分理解如何通过磁珠分选法纯化内胚层细胞。