一种高效诱导人胚胎干细胞定向分化为肝细胞样细胞的方法

人胚胎干细胞来源的肝细胞样细胞在疾病建模和药物筛选中具有重要应用价值。本方法是一种高效且可重复的诱导人胚胎干细胞分化为功能性肝细胞样细胞的技术。人胚胎干细胞的未分化状态及其适当的汇合度对于成功分化为肝细胞样细胞至关重要。

为维持干细胞生长，使用1X人胚胎干细胞级Matrigel对无菌的六孔组织培养板进行包被，每孔加入一毫升，并在4摄氏度下保存过夜。使用前将培养板置于室温下30分钟。将冻存的HESEs在37摄氏度水浴中静置解冻3分钟，不要晃动，然后立即用移液器将干细胞转移至含有4毫升预热至37摄氏度的mTESR培养基的15毫升离心管中。

将HESEs离心并吸除上清液，然后在1毫升mTESR培养基中轻轻重悬细胞。吸除培养板中的DMEM F-12培养基。以每2毫升mTESR培养基接种5×10⁴个细胞的密度将细胞接种至6孔板中，并在含5%二氧化碳的培养箱中孵育。

每天更换预热的mTESR培养基以维持细胞生长。当细胞融合度达到约70%至80%，或细胞克隆开始相互接触时进行传代。传代时，吸除培养基，每孔加入1毫升酶溶液，在37摄氏度下孵育5分钟。

用移液器将细胞转移至含有4毫升预热至37摄氏度的DMEM/F-12培养基的15毫升离心管中。用250微升1X hESC级Matrigel基质胶对24孔板进行包被处理。在500微升mTESR培养基中，以每孔1×10⁵至1.5×10⁵个细胞的密度接种hESC。

在预热的阶段一分化基础培养基中加入激活素A，使其终浓度为100纳克/毫升，同时加入CHIR99021，使其终浓度为3微摩尔。分化三天后，分化所得细胞应表达定型内胚层细胞的标志物，如FOXA2、SOX17、GATA4、CXCR4和FOXA1。在分化第三天，吸除培养基，更换为阶段二培养基，继续孵育24小时。

在第4至第8天期间，每隔一天更换一次培养基。经过8天的分化后，分化所得的细胞应表达肝前体细胞的相应标志物，例如HNF4 alpha、AFP、TBX3、TTR、ALB、NTCP、CEBPA。第8天时，吸去细胞中的第二阶段培养基，并更换为第三阶段培养基。

将细胞置于二氧化碳培养箱中，在37摄氏度下孵育10天，并每隔一天更换一次添加了新鲜分化因子的培养基。经过18天的分化后，分化所得的细胞应表达肝细胞的特征性标志物，如AAT、ALB、TTR、HNF4 alpha、NTCP、ASGR1、CYP3A4。图中展示了由hESCs分化为肝样细胞的示意图及各分化阶段的明场图像。

在第一阶段，加入激活素A（activin A）和CHIR99021，持续三天，以诱导干细胞形成内胚层细胞。在第二阶段，内胚层细胞在分化培养基中处理五天后，分化为肝祖细胞。在第三阶段，经过10天培养，早期肝细胞在肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor）和抑癌素M（oncostatin M）作用下进一步成熟并分化为肝细胞样细胞。

在分化的最后阶段，细胞表现出典型的肝细胞表型。采用RT-PCR、免疫荧光染色和蛋白质印迹法检测内胚层细胞、肝前体细胞以及成熟肝细胞的标志物。分化后的细胞在各个阶段均表现出较高的分化相关基因和蛋白的表达水平，例如第3天的内胚层标志物SOX17、第8天的肝前体细胞标志物HNF4 alpha、第14天的AFP以及第18天的成熟肝细胞标志物ALB。

HLCs 呈现绿色染色和广泛的细胞质酸性转移染色。肝细胞表现出典型的双核形态。通过酶活性测定实验，确认了 HLCs 中 CYP3A4 的酶活性，CYP3A4 是肝脏中关键的代谢型 CYP 酶。

以适当的密度接种人胚胎干细胞，并在次日开始诱导分化至关重要。在第一阶段，操作培养基时应轻柔，因为细胞容易漂浮起来。在此过程中，激活素A与其他小分子的联合使用可进一步提高分化效率，产生更为成熟的肝细胞样细胞。

该技术可为肝细胞移植、肝脏组织工程、人工生物肝脏以及疾病模型研究提供一个平台。