利用脱细胞肺支架生成胚胎干细胞来源的小鼠气道上皮细胞

本实验的总体目标是利用脱细胞肺支架构建的三维培养体系，引导小鼠胚胎干细胞分化为成熟的气道上皮细胞。该方法有助于解答肺发育领域中的关键问题，例如细胞外基质收缩以及生长因子信号在肺谱系分化过程中的作用。该技术的主要优势在于采用明确的无血清三维培养系统，能够实现高效且特异的气道上皮细胞分化，同时最大限度减少其他内胚层谱系的污染。根据文本方案，在对成年Wistar大鼠实施安乐死后，将其前肢和后肢固定于解剖台面，使用70%乙醇喷洒胸部和腹部区域。在肋骨下方做一切口，切开皮肤并暴露膈肌。随后在膈肌上做数个小切口，使肺组织回缩，以降低穿刺肺组织的风险。接着沿胸骨做一纵向切口，打开胸腔以暴露心脏和肺组织。使用缝线结扎下腔静脉，并用小型解剖剪在左心房处剪开一小口。使用预先准备的装有肝素化Hank's平衡盐溶液的10 ml注射器（配备25号针头），将针头插入右心室，开始肺灌注，推动缓冲液通过肺循环系统。持续灌注直至肺组织变为白色，且从左心房流出的液体变得澄清。灌注完成后，暴露气管，并在甲状软骨附近做一小切口以便插管。随后使用塑料导管插入气管，并用缝线固定导管位置。接下来，通过将10 ml注射器固定在铁架台和夹具上，建立重力灌注系统。取出并丢弃注射器活塞。将注射器筒上最大填充刻度线固定在高于肺组织20 cm的位置，然后在注射器末端连接一个双向止流阀，并在止流阀另一端连接一段较长的塑料管。轻轻将导管从气管中拉出，并连接至塑料管末端。将脱细胞溶液倒入注射器中，使其完全充满连接的塑料管和导管。将充满溶液的导管重新插入气管，通过灌注至总肺容量并维持一分钟的方式进行肺灌洗。随后将导管从气管中取出，使液体从肺组织中流出。使用脱细胞溶液重复肺灌洗八次，随后用PBS冲洗十次。完成灌洗步骤后，肺组织将呈现白色。随后从颈部和胸腔中分离气管和肺组织。去除解剖所得肺组织上的多余组织，包括食管和心脏，然后将肺组织转移至冷PBS中，直至准备进行振动切片。为制备厚切片，分别配制约15 ml的2%和4%低熔点琼脂糖PBS溶液，并准备足量6%琼脂糖用于将所有肺叶包埋成小型矩形块。将琼脂糖转移至15 ml离心管后，置于加热块上，保持温度高于40摄氏度，以防止凝胶化。使用小型剪刀在每个肺叶支气管末端处解剖脱细胞肺组织，分离各个肺叶。使用吸水纸去除肺叶表面多余的PBS，然后将肺叶转移至加热块上的2%琼脂糖中，孵育五分钟以包被组织。将每个肺叶转移至培养皿后，将培养皿置于冷板上，使表面凝胶化约一分钟。轻轻将肺叶放入4%琼脂糖中，孵育五分钟并冷却后，再用6%琼脂糖重复包被一次。包被完成后，使用金属底模将每个肺叶单独包埋于6%琼脂糖中，确保组织边缘周围至少有3 ml琼脂糖。随后使用镊子调整每个肺叶的方向，使组织最大的平坦面朝上并面向实验操作者，然后使用塑料包埋盒完成包埋过程。将包埋块置于冷板上至少30分钟，使其完全凝胶化后再进行振动切片。或者，可将包埋块置于4摄氏度的湿润环境中最多保存12小时，再进行振动切片。为制备切片，先设置振动切片机，将切片室充满冷PBS，并设置周围冰浴以在整个切片过程中维持低温。从金属模具中取出包埋块后，使用剃刀片修剪肺叶周围的多余琼脂糖，保留组织边缘约三毫米的琼脂糖。使用粘合剂将组织固定在样品板中央，并将样品板浸入PBS填充的切片室中。将切片刀安装至振动切片机上。在振动切片机上设定切片边界，并分别选择适当的切片速度、振幅和厚度参数。完全切完每个肺叶，若切片未完全分离，可使用小型剪刀手动剪开。轻轻收集支架切片，并转移至冷PBS中。使用镊子小心地将每个切片从周围琼脂糖中分离。为去污染支架切片，将切片从PBS转移至微量离心管后，加入终浓度为90单位/毫升的核酸酶PBS溶液，在室温下旋转孵育12至24小时。将切片转移至新的微量离心管后，根据文本方案，在无菌条件下加入抗菌溶液，在室温下旋转孵育六小时。随后在无菌条件下，使用PBS冲洗支架两次，并将其转移至无血清培养基（SFDM）中，准备接种细胞。为建立气液界面培养体系，使用无菌镊子将疏水性膜放置于培养皿中。将每个脱细胞支架切片从SFDM中转移至膜上，确保切片在膜上均匀铺展。准备六孔或十二孔板，分别在孔中加入1 ml或0.5 ml SFDM。然后轻轻将膜放入孔中，使膜漂浮于培养基表面，形成气液界面培养体系。为接种三维支架，首先完成内胚层细胞的制备及荧光激活细胞分选，以富集确定性内胚层细胞，随后使用血细胞计数板对分选后的细胞进行计数。在400 ×g条件下离心五分钟。使用SFDM重悬细胞沉淀，调整细胞浓度至约100,000个细胞/10 µL