用于刺激载细胞水凝胶中细胞行为的梯度应变芯片

该梯度应变芯片的总体目标是提供一种简单的方法，以在三维水凝胶上产生非连续梯度静态应变，用于研究细胞在一系列应变条件下的行为。该方法有助于回答生物工程领域中的关键问题，例如干细胞分化的刺激以及人工组织器官发育过程中细胞取向的调控。该技术的主要优势在于，可在相同的微环境中对细胞层和水凝胶施加多种不同的应变，从而便于比较细胞行为。

该方法的可视化演示至关重要，因为芯片制备步骤较难掌握，实验基础要求光照必须在三到四小时内完成，以确保细胞具有较高的变异性。称取10克明胶粉末，加入含有100毫升杜尔贝科氏磷酸盐缓冲液（DPBS）的玻璃烧瓶中。将磁力搅拌子放入烧瓶，并将烧瓶置于搅拌加热板上。

用铝箔覆盖烧瓶以防止水分蒸发。将加热板温度设置为 50 至 60 度，搅拌速度设为 100 转/分钟，持续搅拌一小时以溶解明胶粉末。明胶溶解后，使用移液器极其缓慢地加入 8 毫升甲基丙烯酸酐。

在60摄氏度下反应三小时。然后向烧瓶中加入预热的DPBS，至最终体积为500毫升。充分混合溶液15分钟，以终止反应。

同时将透析膜切成若干段，每段长25毫米。将其浸入去离子水中15分钟，并打结封闭透析管的一端。

将适量的聚合物溶液加入透析管中，并封闭另一端。然后将装有溶液的透析管置于盛有去离子水的5升塑料烧杯中，持续透析一周。每天更换去离子水两次，并在透析过程中将溶液温度维持在40至50摄氏度。

透析完成后，将管中的溶液收集到一个500毫升的玻璃瓶中。取约450至500毫升溶液倒入500毫升的滤杯中，并施加真空压力，使溶液通过滤膜以实现灭菌。

然后将灭菌后的聚合物转移至若干个50毫升的灭菌离心管中，并在-80°C超低温冰箱中保存3至5天。使用冷冻干燥机在-80°C条件下对聚合物冷冻干燥一周，以制备GelMA，随后可将GelMA储存于-80°C超低温冰箱中。

芯片制备时，首先按照文本方案中所述的方法制备聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA），并进行铺板和 molding。然后通过将30克PTMS弹性体与3克PTMS固化剂适当混合，制备PTMS盖片和PTMS塞子。将混合物置于真空腔中脱气一小时。

将1.8至2克的混合物倒入PTMS盖用的PMMA模具中。同时，使用适量混合物填充PTMS塞用PMMA模具的每个腔体。此外，将10克未固化的PTMS混合物倒入一个空白的10厘米塑料培养皿中。

将这些模具放入真空室中脱气30分钟。在80摄氏度下固化PTMS两小时。待PTMS在模具上固化后冷却，从PMMA模具上取下PTMS盖片和PTMS塞子。

接下来，在PTMS盖片的流道两端各打两个直径约三毫米的孔。将从10厘米塑料板上模压成型的PTMS片材切割成多个边长为一厘米的立方体，并在每个PTMS立方体上打一个三毫米的孔。

将两个未固化的、边长为一厘米的PTMS立方体粘接到PTMS盖片的开口处，作为培养基储液池，并辅助梯度环状水凝胶图案的固化过程。随后在80摄氏度下固化一小时。接着，将带有两个PTMS储液池的PTMS盖片键合到经TMSPMA包被的载玻片上。

为此，将PTMS盖片的键合面和TMSPMA包被的载玻片置于氧气等离子体仪中，进行90秒的氧气等离子体预处理。将经等离子体处理的PTMS盖片表面与TMSPMA载玻片接触，并紧密压合，通过形成硅-氧-硅键实现永久性键合。通过将已确定的布局打印在透明薄膜上，制作光掩膜。

然后将打印好的光掩模裁剪至25毫米×37.5毫米的尺寸。在1.5毫升黑色微量离心管中，称取25毫克冻干的GelMA，并加入0.3毫升预热的细胞培养基。将微量离心管置于实验室搅拌加热板上，直至GelMA在培养基中完全溶解。

在微量离心管中加入50毫克光引发剂至1毫升DPBS中。然后将其置于80°C的烘箱中15分钟，或直至光引发剂完全溶解。向该微量离心管中加入25微升10%的光引发剂溶液。

反复吹打混匀。随后使用自动细胞计数仪计数三百万个 NIH3T3 细胞。以 200 ×g 离心悬浮液 5 分钟后，弃去上清液，并将细胞重悬于 175 µL 细胞培养基中。

将细胞溶液加入微量离心管中，制备成含有5%GelMA、0.5%光引发剂且每毫升约含六百万个3T3细胞的预聚合细胞溶液。混合后，取100微升细胞预聚物溶液加入100微升微量注射器中。手动将一块光掩膜对准无菌梯度应变芯片的底片。

然后在中间滴加一滴去离子水以固定位置。将装有预聚物细胞溶液的 100 微升微量注射器连接到芯片的入口。接着，使用微量注射器将 50 微升预聚物细胞溶液注入流动通道，并用 PDMS 塞子封闭出口。

注入额外的40微升溶液，以在圆形PTMS膜上形成凸起。将带有光掩模、微注射器和PTMS塞的芯片移至紫外灯下，照射30至45秒，使流体腔室中的同心圆形水凝胶发生交联。

交联后，移除PTMS塞子和微型注射器以释放液体压力。使用装有预热DPBS的一毫升注射器，从入口向出口冲洗三次，洗去未交联的树脂。接着，用约100微升细胞培养基填充流道。

将芯片置于无菌培养皿中，在37摄氏度、5%二氧化碳气氛下培养一周。每天更换培养基。在孵育4小时后的第0天，对三个芯片进行成像，作为对照组。

在第三天，使用20倍物镜的显微镜观察实验组的三个芯片。利用软件测量每条水凝胶从第一条线到第12条线的线宽，以计算压缩应变。此处展示的是在紫外交联及4小时孵育后，过量注射0微升和40微升条件下的水凝胶图案的代表性结果。

非过量注射对照组中的3D水凝胶线宽均匀，符合预期。然而，加入40微升过量注射的水凝胶图案则显示出从第一条线到第12条线水凝胶线宽逐渐减小的梯度变化。经过三天培养后，水凝胶中的细胞向不同方向伸展。

第一行的细胞由于水凝胶拉伸的刺激而沿径向排列。相反，第12行的细胞则沿着水凝胶的形状排列，其中几何线索主导了细胞的排列方向。在第7行，细胞没有特定的排列方向，因为第一行和第12行的两种细胞排列线索相互平衡。

如果操作得当，使用梯度应变芯片可在两小时内完成对3D水凝胶上梯度应变微环境的测量。在进行该操作时，需注意在加载细胞预聚物溶液前，必须对梯度应变芯片进行灭菌处理。此外，在将芯片放入细胞培养孵育箱之前，应使用75%乙醇彻底擦拭芯片表面。

观看本视频后，您应能充分掌握如何制备梯度应变芯片，以研究细胞在不同应变条件下的行为。