设计用于研究细胞在单一或共存化学/电/剪切应力刺激下响应的微流控装置
2016年8月13日
集成流体组件的微加工器件为 体外 模拟细胞研究的平台 体内 微环境。我们开发了基于聚甲基丙烯酸甲酯的微流控芯片，用于研究细胞在单一或共存的化学、电场和剪切应力刺激下的响应。
本实验的总体目标是设计并制备用于观察细胞对环境刺激响应的微流控装置。该方法有助于解答细胞生物学与生物医学工程领域中的关键问题，例如细胞在不同环境刺激（包括化学物质、剪切应力和电场）下的反应机制。该技术的主要优势在于微流控装置易于加工和组装，且这些装置能够以优异的能力模拟体内环境。演示本实验操作的是来自我实验室的本科生周子元（Tzu-Yuan Chou）以及朱利安·钟（Julian Chung）博士实验室的博士后研究人员侯贤三（Hsien-San Hou）。首先，打开二氧化碳激光刻蚀机，并检查其与计算机的连接状态。然后，加载预先设计好的图案（例如此处所示的圣诞树图案）至刻蚀机中。接着，将一块聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）板材或双面胶带放置于刻蚀机工作台表面。使用校准杆和可见的氦氖激光调节二氧化碳激光的焦距。随后，将图案刻蚀到基底材料上。刻蚀完成后，取下带有图案的基底，移除不需要的部分，并用氮气流吹扫表面，清除残留碎屑。对芯片的每一部分重复此过程。组装化学剪切应力微流控芯片：将三层化学剪切应力图案化的PMMA板材通过两片刻蚀后的双面胶带粘合在一起。使用快干胶将带有螺纹的丙烯酸适配器对准并固定在芯片最上层的PMMA层中央。这些适配器将作为培养基的进样口、出样口以及盐桥连接器。然后，在芯片底部再添加一片厚度为0.7 mm的双面胶带，并将芯片粘附至一个直径为10 cm的培养皿上。组装完成后，将芯片置于真空腔中过夜。接下来组装化学-电场微流控芯片：将用于化学-电场芯片的刻蚀PMMA板材通过双面胶带粘附至一个直径为10 cm的培养皿上。在使用芯片前，需将其暴露于紫外线下30分钟以进行灭菌处理。随后，通过塑料管和指旋螺母将芯片的进样口连接至装有3 ml磷酸盐缓冲液（PBS）的注射器；同样方式将出样口连接至废液管。缓慢推动注射器活塞，用PBS预润湿流体通道。前后推动注射器以排除气泡，然后将芯片放入培养箱中过夜。为设置化学-电场芯片，需在管状螺母中填充3%琼脂糖以构建盐桥。随后将银/氯化银电极插入管状螺母中。在含10%胎牛血清（FBS）的D-MEM培养基中培养肺腺癌CL1-5细胞，直至细胞融合度达到90%。吸除旧培养基，用预热的PBS洗涤细胞一次，并向直径为10 cm的培养皿中加入2 ml浓度为0.5%的胰蛋白酶缓冲液。将细胞重新置于37
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概述
本研究展示了集成流体组件的微加工器件，构建了一种用于细胞研究的体外平台，可高度模拟体内微环境。该研究聚焦于基于聚甲基丙烯酸甲酯的微流控芯片，旨在探究细胞对多种刺激的响应。
关键研究组成部分
科学领域
- 微流控技术
- 细胞生物学
- 体外研究
背景
- 微加工器件可增强对细胞环境的研究。
- 流体组件可实现对实验条件的精确控制。
- 理解细胞响应对于多种生物学应用至关重要。
- 聚甲基丙烯酸甲酯是微流控应用中一种多功能材料。
研究目的
- 建立一个在受控环境中研究细胞反应的平台。
- 利用微流控技术模拟体内环境条件。
- 研究化学、电刺激和剪切应力对细胞的影响。
使用的方法
- 使用聚甲基丙烯酸甲酯设计和制造微流控芯片。
- 集成流体组件以增强实验控制能力。
- 施加多种刺激以评估细胞反应。
- 通过体外实验模拟体内环境条件。
主要结果
- 成功开发用于细胞研究的微流控芯片。
- 证明了有效控制环境条件的能力。
- 观察到细胞对不同刺激产生的明显响应。
- 揭示了细胞与其微环境之间相互作用的机制。
结论
- 微流控平台是研究细胞行为的有力工具。
- 研究结果有助于深入理解细胞在受控环境中的响应机制。
- 未来应用可能包括药物测试和疾病建模。
常见问题
行业重要性概述
能够精确控制化学、电学和剪切应力刺激的微流控平台，通过模拟复杂的体内微环境，为生物制药研发提供了一种可扩展的方法，以降低靶点验证的风险。这些基于聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）的装置提高了在多种共存刺激条件下筛选细胞反应的实验通量，有助于在早期发现阶段获得机制性见解。该技术有助于在投入资源进行先导化合物筛选之前，优先选择具有更高预测可信度的靶点。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：可检测细胞对化学梯度、电场和剪切应力的响应，有助于阐明信号通路在疾病机制中的作用。
- 操作价值：PMMA基底可通过激光烧蚀实现低成本、快速制备，支持在目标假设验证中进行迭代设计。
- 预测价值：可在明确定义的刺激条件下定量检测活性氧生成和细胞迁移，为目标靶点的风险评估提供功能性读数。
筛选与检测方法开发
- 科学价值： 在单个装置中同时生成五种浓度梯度以及剪切应力或电场梯度，实现在同一设备内的多参数筛选。
- 操作价值： 通过整合多种刺激条件，减少实验重复次数，提高化合物或siRNA文库筛选的检测效率。
- 可扩展性： 与标准显微镜观察和培养工作流程兼容，便于在筛选级联中推广应用。
转化与临床前研究
- 转化连续性：采用与疾病相关的肺癌 CL1-5 细胞模型，研究微环境驱动的细胞表型。
- 机制去风险化：分离化学、电和机械刺激对细胞反应的独立作用，为联合治疗策略提供依据。
- 临床前一致性：迁移和氧化应激等输出指标与转移和侵袭相关的关键特征相吻合。
流程与工作流整合
微流控芯片作为一种发现阶段的检测平台，在靶点验证与早期先导化合物筛选之间发挥桥梁作用，可提供定量的、响应刺激的细胞表型。
- 发现生物学：支持在癌症及其他疾病模型中，针对微环境信号如何调控细胞行为的假设验证。
- 筛选：可在化学浓度梯度和物理刺激梯度上并行测试细胞反应，提高每次实验的数据密度。
- 分析：生成可量化的输出结果，包括基于荧光的活性氧检测和延时成像迁移指标，用于客观比较。
- 转化研究：利用转移性肺癌细胞系，将微环境响应与疾病相关的侵袭表型关联起来。
- 企业级复用：基于PMMA的设计可在不同实验室和项目间复制，确保在力学生物学或药理学研究中刺激递送的一致性。
运营与企业影响
- 科学价值：通过可控地施加单一或共存的刺激，分离变量贡献，减少机制上的模糊性。
- 操作价值：通过可重复的梯度生成标准化刺激递送，最大限度降低重复实验间的变异性。
- 战略价值：在生理相关条件下提供多参数的疗效和毒性读数，从而优化“进行/不进行”决策。
- 项目组合影响：通过识别调节特定刺激细胞反应的化合物，支持基于风险调整的目标优先级排序。
实施注意事项
- 需要具备微流控设计、PMMA激光烧蚀以及流体接口组装方面的专业知识。
- 依赖于CO2激光划片仪、紫外灭菌设备以及注射器和管路等流体预充装备的可用性。
- 需要在不同团队之间对细胞接种、刺激施加时间以及检测信号归一化进行标准化。
- 应用于其他细胞类型时，可能需要优化通道尺寸和流速，以维持剪切应力和浓度梯度的完整性。
- 实际限制包括引液过程中气泡的形成，以及电场实验装置中电极的脱层问题，如实验方案中所述。
