一种用于细胞生物学的梯度生成微流控装置

我叫Jiang。我是哈佛大学和麻省理工学院健康科学与技术系的博士后研究员。我叫Amir Manchi，是哈佛大学麻省理工学院健康科学与技术部SANE实验室的本科生。

此幻灯片展示了制作该器件的流程示意图：首先在硅烷蒸气层上进行 SUA 50 旋涂，然后将掩膜版置于硅烷蒸气层上方，接着进行紫外曝光并显影。最终可在此硅烷蒸气层上形成电极阵列。之后，浇铸 PDMS，进行脱模和烘烤，再用打孔器打孔，最后通过氧等离子体处理实现 PDMS 器件与玻璃片之间的键合。

好的，我们现在位于实验室内的微加工室内，首先将制作一些PDMS层。我所说的PDMS，其正式的科学名称为聚二甲基硅氧烷，是一种有机聚合物，也是应用最广泛的硅基有机聚合物。

实际上，这是两种不同物质的混合物，即硅胶弹性体基础剂与硅胶弹性体固化剂的混合物。两者的比例为基础剂10份，固化剂1份。我们需要约10克基础剂，相应地就需要约1克弹性体固化剂，接下来我将尝试将基础剂和固化剂充分混合均匀。

我将使用移液器。现在混合物已经准备好，我将把它滴加到硅片表面。这些硅片的表面具有一些特定的图案。

它们实际上有助于使这种PDMS聚合物形成所需图案，我们利用这些图案在聚合物上制备出通道、凹槽或任何其他所需的结构。下一步是，由于该混合物内部存在大量气泡，我们将尝试将其放入真空环境中，以消除聚合物内部的气泡。我会将PDMS凝胶放置在真空腔内的硅晶圆上。

我将关闭腔室，然后打开真空。待气泡消失后，大约几分钟，将其放入烘箱中过夜，温度约为70摄氏度，这将使样品固化。我需要您注意的图案是这三个不同的储液区域，用于形成浓度梯度，使得一侧浓度为零，另一侧具有特定浓度，并沿此方向均匀过渡。我们还将在另一端制作一个小孔，作为本实验中的出口。

下一步是裁剪其中一个图案，并将其转移至培养皿中，使图案面朝上。希望您能够看到我之前向您解释过的该图案上的三个入口和一个出口。我们将使用小冲孔器制作入口，以便能够使用聚乙烯管；而出口将使用较大的冲孔器，以留出足够的空间。

首先，我们将从第一个入口开始。我会打一个孔，第二个入口同样处理，第三个入口则打一个较小的孔。最后一步是在出口处打一个较大的孔。

因此，完成之后，我们将得到 A-P-D-M-S 层，这是顶层，而我将在底部使用另一层玻璃。这些显微载玻片将作为微叶酸器件的底层。现在我们位于微加工实验室，我有一块玻璃和一层 PDMS，需要将它们彼此粘合在一起。

我们现在将使用一种称为等离子清洗机的设备。在腔室内会发生的过程是：等离子体有助于破坏表面的弱结合层，并将其替换为高反应性的化学基团，同时表面也会变得亲水。接下来的操作是，我将取出之前制备的PDMS模具（即顶层，内部含有微通道），并撕去先前为防止灰尘附着而贴上的胶带。

我将把它放入腔室内。接下来，我有一块玻璃层，即显微镜载玻片，这将作为装置内部的底层。因此，我也要将这块玻璃放入腔室内。

关闭腔室后，先关闭电源，再关闭泵，然后我们需要在大约五分钟内返回这台设备。接下来，我需要关闭设备：先关闭泵，再关闭电源，然后打开腔室。

这种声音实际上是由于在腔室内进行操作时施加了负压所致。接下来，我将取出不同的层，并将它们粘合在一起。由于玻璃是底层，我将用左手固定住玻璃层，然后取PDMS层，将其放置在玻璃层的上方。

但由于目前这些图案实际上是朝上的，我需要将PDMS层翻转一下。在将它们压合之后，我会将其放置在玻璃上。它们能够非常容易地粘附，而这种等离子体处理工艺的优势之一就在于其粘附强度和永久性。

最终效果就是这样。再次说明，这些是我们的进样口，这是我的出样口，接下来我们就可以进入下一步了。将装置内的纤维进行孵育，放入培养箱中孵育一小时，一小时后从培养箱中取出一个SIM样本，然后加入鱼类培养食物，接着配制溶液。

为了配制EGF溶液，我们只需将两毫升培养基加入Azure中，并加入15纳克/毫升的EGF和10微摩尔的50D，以充分混匀该溶液，便于在通道中清晰观察EGF浓度梯度。然后，我们再取两毫升培养基，即虚拟培养基，加入此处，再加入另外两毫升培养基。这两个位置仅用于常规培养，即正常的培养灌注，置于装置中。

因此，我先去除气泡，再次连接，此时又有一个M型移动气泡流下。然后，我仅使用15纳克的EGF、10微摩尔的荧光素标记的葡聚糖以及2毫升从取出物中获得的培养基样本，将其装入注射器，注意避免产生气泡。接着进行溶液切换，再切换回原状态。

将溶液吸入气体型注射器中，反复推动SH数次以排除气泡。所有切换注射器的溶液先在此处汇集，然后切换三通阀，使溶液经三通阀、接头及管路流出。待混合后的溶液流出后，即可将管路插入My Predict设备中。此时所有三种溶液已完全一致，可轻柔地连接输注通道的入口端。

因此，最终两种为正常培养基，一种为含表皮生长因子（EGF）的培养基，用于确认EGF的浓度梯度分布。此为网络中的细胞，网络中的细胞。

这将是细胞的出口，因此通过三个枢纽通道生成梯度，然后在细胞区域内部建立梯度。通常情况下，我们首先进行细胞接种，将细胞悬液加入出口处，然后轻轻抽吸使液体流入，细胞随之流经细胞区域并自动附着沉降，覆盖于包被表面，随后确保细胞完全铺展。在确认细胞已完全铺展后，即可开始灌注，利用梯度生成装置研究细胞迁移。