利用光激活型激动剂实现T细胞活化的时空控制

本实验方案的总体目标是描述如何利用光激活肽MHC来诱导T淋巴细胞中的极化信号。该方法有助于解答免疫细胞信号转导领域中的关键问题，例如淋巴细胞如何转导快速的局部信号，并对这些信号产生极化的细胞反应。该技术的主要优势在于能够对T细胞信号进行时空精确控制。

通过固定T细胞受体激活的精确时间和位置来实现这一目的。演示该实验步骤的是我实验室的研究生Elisa Sanchez。首先，将生物素化的聚-L-赖氨酸（bio-PLL）用去离子蒸馏水按1:500比例稀释后，加入八孔腔室盖玻片中。

室温孵育30分钟。孵育结束后，用去离子蒸馏水洗涤，然后在室温下干燥2小时。使用含有2% BSA的HEPES缓冲盐水封闭液，在室温下封闭生物多聚赖氨酸（bio-PLL）包被的表面，封闭30分钟。

孵育结束后，从包被了生物素化聚赖氨酸（bio-PLL）的表面去除封闭缓冲液，注意不要让孔板干燥。随后加入链霉亲和素，在4°C条件下孵育。一小时后，用HBS缓冲液洗涤包被表面。

将腔室载玻片的孔重复填充并倒置四到五次，以去除孔中的HBS。切勿让孔干燥。向生物-PLL包被的表面加入针对CD4阳性T细胞或CD8阳性T细胞的特异性生物素化光活化肽-主要组织相容性复合物配体以及黏附分子。

避光，室温孵育1小时。孵育结束后，按前述方法洗涤，并置于HBS中直至准备铺板。最后，向相应的孔中加入200,000个表达相应TCR的CD4阳性或CD8阳性T细胞，于37°C孵育15分钟，使细胞贴壁。

待细胞贴附并铺展于表面后，即可进行光激活和成像。使用配备紫外兼容的150倍物镜的倒置全内反射荧光显微镜进行图像采集。分别采用488纳米和561纳米的激发激光，同时在绿色和红色通道中监测探针信号。

安装含有T细胞的腔室载玻片后，根据需要调整显微镜设置，以获得TIRF或落射荧光照明。在实时模式下，选择表达目标荧光探针的细胞视野。利用软件控制，在单个细胞下方设定微米尺度的光激活区域。

然后，开始采集。通常需要采集80个时间点，每个时间点间隔5秒。这样可在双色实验中为488纳米和563纳米的依次曝光留出时间。

然后，在获取10个时间点后，打开数字光圈快门1至1.5秒，对选定区域进行光激活。时间序列成像完成后，选择新的细胞视野并重复该过程。首先，确定细胞外一个背景区域的荧光强度，用于背景校正。

在细胞外绘制一个微米级的方形区域并创建掩膜。为确定荧光强度，点击分析（Analyze），掩膜统计（Mask Statistics）。选择平均荧光强度，并导出数值。

确定每个时间点光激活区域内的荧光强度。选择“Mask”以高亮显示被光激活的区域。为确定荧光强度，请点击“Analyze”（分析），然后选择“Mask Statistics”（区域统计）。

选择平均荧光强度并导出数值。通过选择“掩膜”以高亮光激活区域，获取该区域中心的 X 和 Y 坐标。当光激活区域被高亮后，选择“分析”、“掩膜统计”、“面积中心”，然后导出数值。

确定目标荧光探针的 X 和 Y 坐标。选择手动粒子追踪，随时间推移点击目标荧光探针。完成所有时间点的追踪后，选择分析、掩膜统计、面积中心，并导出数值。

T细胞被附着在含有光可激活MCC-IEFK的腔室盖玻片上。使用全内反射荧光显微镜观察DAG脂质第二信使探针C1-GFP，并以落射荧光模式观察RFP-微管蛋白。在T细胞下方局部进行光激活，可诱导DAG在照射区域聚集。

数秒后，中心体将重新定向至同一区域。可通过计算光激活区域中心经背景校正后的归一化荧光强度随时间的变化来定量分析C1-GFP的累积。中心体对光激活的重新定向可通过计算中心体与光激活区域中心之间的距离随时间的变化来进行定量分析。

一旦掌握，该技术若操作得当，可在不到一天的时间内完成。在此期间，我们通常可生成 15 到 20 个延时成像视频用于分析。该方法为研究人员探索 T 细胞中激活信号传导的精确动力学和极化过程奠定了基础。

该方法还被用于研究自然杀伤细胞中的抑制性信号传导。因此，我们现在对免疫细胞间通讯相互作用的组装与解聚机制有了更深入的理解。