利用酵母表面展示技术进行蛋白质工程

在我的实验室中，我们通过将蛋白质工程与细胞工程相结合，来设计下一代细胞疗法。我们对蛋白质组分进行改造，以获得新功能或优化现有功能，然后将这些改造后的蛋白质整合到细胞治疗剂中。我们进一步开发了表面展示技术，用于特定应用，包括蛋白质稳定性工程、小分子调控的蛋白质开关工程，以及针对癌症相关活化受体构象的特异性靶向。

相较于噬菌体展示或核糖体展示等其他展示技术，酵母表面展示的优势在于能够在分选过程中通过流式细胞术对文库进行可视化观察，并可精确控制筛选条件，例如抗原浓度和分选门控的严格程度。首先，通过将10微升生物素结合磁珠重悬于990微升PBSA中，来准备第一次磁珠筛选所需的磁珠。洗涤时，将离心管置于磁力架上，打开管盖，静置两分钟。

然后小心移除上清液。将洗涤后的磁珠重悬于1.5毫升微量离心管中，加入1毫升含6.7至33皮摩尔生物素化抗原的PBSA溶液。孵育后，将试管置于磁力架上静置2分钟（管盖打开），移除上清液，并用1毫升PBSA洗涤负载抗原的磁珠。

待磁珠沉降后，移除 PBSA。然后将负载抗原的磁珠重悬于 50 微升 PBSA 中。准备细胞、抗原磁珠以及用于阴性筛选的磁珠溶液。

洗涤后，将抗原偶联微球重悬于 50 微升 PBSA 中，并将裸微球重悬于 150 微升 PBSA 中。进行第一次阴性筛选时，将 50 微升洗涤后的裸微球加入 950 微升洗涤后的细胞悬液（PBSA 中），在 4 摄氏度下孵育 1.5 小时。孵育结束后，将含有裸微球-细胞悬液的离心管置于磁力架上，并打开管盖。

将盖子中的任何液体用移液器吸入离心管中，静置两分钟。然后将未结合的细胞转移至新的微量离心管中，并加入50 µL洗涤过的磁珠。经过三轮阴性筛选后，向细胞中加入50 µL抗原负载的磁珠溶液。

在 4°C 下孵育两小时。现在将含有抗原负载珠的细胞置于磁力架上，并打开管盖。用移液器将管盖内的任何液体转移至离心管中。

等待两分钟后，弃去未结合的细胞。其余所有步骤均按照第一种抗原磁珠筛选方法所述进行操作。经过三次阴性筛选和一次阳性筛选后，将细胞迅速重悬于1毫升SDCAA培养基中，并转移至含有较大量SDCAA培养基的摇瓶中。

在酵母文库中于SGCAA培养基中过夜诱导蛋白质表面表达后，收集足够量的细胞沉淀，沉淀量应覆盖文库多样性的10倍，弃去上清液。将沉淀重悬于PBSA中，并转移至微量离心管。每管使用三千万个细胞进行染色。

根据实验多样性准备相应数量的离心管，包括一个不含抗原的对照管。随后在室温下以2000 × g离心5分钟。将沉淀重悬于200 µL含有抗原的PBSA中，并在4 °C孵育1小时。

再次离心后，从沉淀中去除 PBSA。接着将细胞重悬于 100 微升含有用于表面染色和抗原检测的抗体的冷 PBSA 中。在 4 摄氏度下孵育 30 分钟。

孵育后，在4摄氏度下以2000 × g离心5分钟。向沉淀中加入1毫升PBSA，并重复离心步骤。然后移除大部分上清液，仅留下20至30微升，以防止沉淀干燥。

分选前立即用预冷的PBSA重悬沉淀。随后直接将细胞分选至SDCAA培养基中。分选后，将细胞转移至含有较大量SDCAA培养基的摇瓶中，在30摄氏度、180 RPM振荡条件下孵育。