高盐处理抗原提呈树突状细胞的分离与过继性转移

该方法可解答高血压和心血管疾病领域中的关键问题，包括研究CD11c阳性树突状细胞及其在高血压损伤中所起的增强作用。该技术的主要优势在于能够从实体器官中分离出CD11c阳性树突状细胞，并研究其在多种疾病状态下的生理功能。因此，该流程可应用于多种免疫细胞类型，包括B淋巴细胞、T淋巴细胞、单核细胞和巨噬细胞。

该技术的可视化对于理解树突状细胞的分离，特别是将其过继转移至受体小鼠的过程至关重要。首先，用70%乙醇喷洒已处死小鼠的胸部和体侧。在左侧，小心切开皮肤和腹腔，以暴露脾脏。

用小镊子小心地将小鼠的肠道和肝脏移至左侧，然后用小剪刀轻轻切除脾脏。将每份切除的脾脏放入含有 3 mL RPMI 1640 培养基的已标记 C 管中。

首先将胶原酶D和DNase加入配制好的RPMI 1640培养基中，以制备脾脏消化液。将C管置于半自动匀浆仪上，并确保管子牢固地安装在旋转臂上。按下匀浆仪上的启动按钮，运行脾脏04.01程序，持续60秒。

此后，将离心管从匀浆器上取下，在 37 摄氏度、20 rpm 持续振荡条件下孵育 15 分钟。接着，将溶液经 40 微米滤网过滤后，用移液器转移至 50 毫升锥形管中。用 10 毫升 dPBS 清洗滤网。

将细胞在300 × g、4 °C条件下离心10分钟。然后完全吸除上清液，并通过在10 mL dPBS中重悬沉淀来洗涤。将悬液在300 × g、4 °C条件下再次离心10分钟。

将细胞沉淀重悬于5毫升dPBS中。使用血细胞计数板和台盼蓝排斥法计数细胞数量。随后在4°C下以300 × g离心10分钟，使细胞沉淀。

完全吸除上清液，并将沉淀重悬于 400 毫升磁性激活细胞分选缓冲液中。然后每 1 亿个细胞加入 100 毫升 CD11c 微珠。涡旋混匀细胞悬液，并在 4 摄氏度冰箱中孵育 10 分钟。

此后，加入 10 毫升 MACs 缓冲液洗涤细胞，在 4 摄氏度下以 300 × g 离心 10 分钟。彻底吸除上清液，将细胞重悬于 500 毫升 MACs 缓冲液中。将 LS 柱置于磁力分离器的磁场中，并在每根柱子下方放置一个 15 毫升锥形管以收集流穿液。

接着，用三毫升缓冲液冲洗层析柱。将细胞悬液加到每根层析柱上，收集流出液，其中含有未标记的细胞。用三毫升MACs缓冲液洗涤层析柱，并收集穿过的未标记细胞。

使用3毫升MACs缓冲液，再对LS柱进行两次洗涤。随后，将LS柱从磁性分离器上取下。向每根柱中加入5毫升MACs缓冲液，并立即将每根柱插入干净的15毫升锥形管中，以冲洗出磁标记的细胞。

使用血细胞计数板和台盼蓝排斥法测定 CD11c 阳性 DC 的数量，具体步骤如文本方案中所述。然后，将细胞样品以 1:1 的比例稀释于 0.4% 台盼蓝溶液中。首先，按照文本方案中的说明，用 DC 培养基制备细胞沉淀。

用移液器将900微升DC悬液加入24孔平底Falcon板中。每孔加入100微升高盐DC培养基，使终浓度为190毫摩尔/升钠离子。标记培养板，并将其置于37摄氏度、加湿的二氧化碳培养箱中培养48小时。

48小时后，从培养箱中取出培养板。用移液器将单个孔中的细胞培养基上下吹打，以重悬CD11c阳性树突状细胞。将全部悬液转移至相应标记的1.6毫升离心管中。

对每个接种的孔均重复此操作。将所有试管在300 × g、4°C条件下离心10分钟。吸除上清液，并用100 µL无菌dPBS重悬DC沉淀。

接下来，用一支配有27号半英寸针头的1毫升注射器，从其中一根试管中吸取DC溶液。将一只10周龄的未处理C57-black-6雄性小鼠置于2%异氟烷中，以达到稳定的手术麻醉状态。通过脚趾反射消失来确认麻醉深度。

当达到稳定的手术平面后，缓慢而谨慎地以约30度角将针头插入眶后腔。缓慢且平稳地注入CD11c阳性树突状细胞悬液。注射完成后，小心地将针头从眶后腔取出，注意避免损伤眼球。

然后将小鼠从鼻罩中取出，并在麻醉恢复期间监测约30分钟。此处显示的是在过继转移树突状细胞并植入用于低剂量血管紧张素II输注的渗透性微型泵后，典型的血压分析结果。需要注意的是，该低剂量血管紧张素II具有抑制作用，在正常小鼠中不会引起血压升高。

接受正常盐处理的CD11c阳性树突状细胞的小鼠在输注期间维持正常血压，而接受高盐处理的CD11c阳性树突状细胞的小鼠则表现出收缩压升高。随后采用此处所示的设门策略进行流式细胞术分析，以确定分离得到的CD11c阳性细胞的纯度。与总脾细胞相比，CD11c阳性细胞的富集程度显著增加。

使用不同浓度的CD11c微珠来优化生产商的实验方案。利用100微升微珠对脾细胞进行磁性分离，可获得约65%的CD11c阳性细胞，而使用200微升时得率为55%，使用300微升时得率为50%。在使用100微升微珠的同时加入FcR阻断剂。磁性分离后，FcR阻断可获得约65%的CD11c阳性细胞。

随后将部分脾细胞与100 µL微珠共同孵育，并通过LS柱进行磁性分离。分离后的细胞再与额外的100 µL CD11c抗体孵育，并再次通过LS柱进行分离。此双重分离过程可获得92% CD11c阳性细胞。

在进行该操作时，必须通过流式细胞术确认所分离细胞的纯度。在通过磁珠分离获得树突状细胞后，可对其进行培养，并利用蛋白质组学和单细胞测序等分子生物学技术检测其活化状态。自该技术建立以来，现已能够研究树突状细胞在高血压中的功能及其特定作用。

研究人员目前正在探索高血压中的特异性抗原。