通过聚集实验研究冠蛋白A在Dictyostelium discoideum早期饥饿反应中的功能

本实验方案的总体目标是研究盘基网柄菌（Dictyostelium discoideum）中依赖Coronin-A的早期饥饿应答。该方法有助于解答发育生物学领域中的关键问题，例如鉴定参与盘基网柄菌早期发育过程的信号通路及相关因子。该技术的主要优势在于，有望为发育诱导因子及早期发育信号通路相关蛋白的自动化高通量筛选提供一种有效工具。

通常，初次接触该方法的研究人员会因实验本身存在的多个变量而遇到困难，例如细胞密度、贴壁时间以及发育时间。开始本实验前，需将 DH1.10 细胞或 corA 缺失型细胞在含有 HL-5 培养基的锥形瓶中，于 22°C、160 rpm 的摇床培养箱中培养。细胞密度应维持在每毫升 1×10⁴ 至 2×10⁶ 个细胞之间。

为了检测细胞聚集，收集10至50毫升处于对数生长期的DH1.10细胞或在DH1.10背景下构建的corA缺陷型细胞。在400 × g条件下离心3分钟。随后用BSS缓冲液将细胞洗涤两次。

随后使用血细胞计数板对细胞进行计数。接着将细胞接种于24孔板中，在BSS中于22°C孵育1小时使其贴壁。

然后，使用延时显微镜观察细胞聚集过程，并每135秒拍摄一次图像。为了检测外源施加的环磷酸腺苷（cAMP）脉冲对DH1.10细胞或DH1.10 corA缺陷型细胞发育的影响，收集10至50毫升细胞，在400 × g条件下离心3分钟。随后，用BSS缓冲液洗涤细胞两次。

使用血细胞计数板对细胞进行计数。随后，将细胞重悬于BSS中，调整细胞密度至每毫升1 × 10⁷个细胞。然后，在施加脉冲前，于22°C、160 rpm条件下振荡培养2小时。

接下来，使用由定时器控制的蠕动泵施加环磷酸腺苷（cyclic AMP）脉冲。将泵程序设置为在五小时内，每六分半钟输送一次持续五秒的环磷酸腺苷脉冲。关键步骤是确保环磷酸腺苷注射管的尖端不持续浸没在溶液中，而仅在摇床产生的液面波动中周期性地浸入。

加入环磷酸腺苷（cAMP）后，使用血细胞计数板再次对细胞进行计数。随后将细胞接种于24孔板中，在BSS中孵育1小时使其贴壁。16小时后，在22°C条件下，使用5倍物镜通过明场显微镜观察细胞聚集情况。

在此步骤中，通过从含HL5培养基、在22摄氏度下振荡培养的对数期DH1.10细胞或DH1.10 corA缺陷型细胞中收集细胞，制备新鲜的条件培养基。以400 × g离心3分钟。随后，用PBM洗涤细胞3次。

随后，使用血细胞计数板对细胞进行计数，然后将细胞以每毫升1 × 10⁷个细胞的密度重悬于PBM培养基中，在22°C、110 rpm条件下振荡培养20小时。接着，在400 × g离心3分钟，收集条件培养基。之后，在4°C条件下以8,000 × g离心15分钟，对培养基进行澄清处理。

然后，将条件培养基通过 0.45 微米滤膜过滤，并用 PBM 稀释三倍。使用血细胞计数板对细胞进行计数，将细胞接种于 24 孔板中，在 22 °C 下孵育 1 小时使其贴壁。接着，将细胞的上清液更换为预先制备好的条件培养基。

16 小时后，使用五倍物镜通过明场显微镜观察细胞聚集情况。此处，冠蛋白 A 缺陷的细胞在早期发育中表现出缺陷，无法形成多细胞聚集体，而多细胞聚集体是盘基网柄菌发育周期的初始步骤。在本图中，营养生长期的野生型细胞和 corA 缺陷型细胞经洗涤后饥饿处理 2 小时，随后在悬浮状态下每隔 6.5 分钟给予或不给予 15 nmol 的环磷酸腺苷（cAMP），共脉冲处理 5 小时。

外源性环磷酸腺苷脉冲的应用完全恢复了野生型表型。在本图中，将处于指数生长期的野生型和corA缺陷型细胞用PBM缓冲液洗涤后，接种至多孔板中，并在来自野生型或corA缺陷型饥饿细胞的条件培养基中孵育。细胞接种16小时后拍摄图像。

corA缺陷型Dictyostelium discoideum能够产生发育诱导所需的所有因子，但无法对这些因子作出响应。一旦掌握，若操作得当，包括孵育时间在内，该技术可在20小时内完成。在进行该实验时，需注意不同菌株可能需要调整检测中的多个变量，例如细胞密度、贴壁时间以及发育时间。

通过本实验步骤，可进行生化分级分离及后续的蛋白质组学分析，以鉴定参与盘基网柄菌（Dictyostelium discoideum）早期饥饿应答的相关因子。观看本视频后，应能够充分掌握如何在液体培养条件下，利用条件培养基或环磷酸腺苷（cyclic AMP）脉冲诱导盘基网柄菌的早期发育过程。