利用 pGR-Blue 质粒和 Golden Gate 连接快速验证终止子

合成生物学实验方案的总体目标是利用黄金门组装技术，在体外系统中快速确定终止子的功能并量化其强度。该方案用于验证我们通过生物信息学方法在计算机中发现的终止子，并在实际生物学环境中进行测试，从而能够在实验台操作层面快速、简便地确认经生物信息学鉴定的终止子。

本方案的主要优势在于其快速性。我们可以在不到一周的时间内完成从生物信息学鉴定到生物学验证的全过程。在此过程中，我们还能够确认一个序列是否确实具有终止子功能，并可对其终止效率进行定量分析。

通常情况下，人们最初会对这一技术感到困难，因为在同一个反应管中同时加入限制性内切酶和连接酶听起来违反直觉。然而，我们使用的是2S型限制性内切酶，其识别位点与实际切割位点是分开的。一旦终止子被连接到 pGR blue 质粒中，这种连接便是永久性的。

然而，通过在同一管中同时加入限制性内切酶和连接酶，并经历多个循环，我们可以实现高效的克隆效率。开始此操作时，先将各个寡核苷酸溶解于无核酸酶的水中，浓度为 100 微摩尔，然后配制 10 倍退火缓冲液。接下来，为每个待检测的终止子标记一个 1.5 毫升的微量离心管。

向每个离心管中加入 16 µL 超纯水、2 µL 10x 退火缓冲液，以及各 1 µL 所需终止子的上游和下游链寡核苷酸。务必确保订购的寡核苷酸具有正确的黏性末端，因为一旦它们退火结合，必须保证终止子处于正确的方向。

如果终止子的方向错误，pGR 蓝色载体将无法验证其是否为有功能的终止子。接下来，将微量离心管放入浮架中，并在水浴中煮沸四分钟。四分钟后，关闭加热板，但将离心管留在水中过夜，使其缓慢冷却。

将退火终止子储存于 20 摄氏度。为制备 40 纳摩尔的退火终止子稀释液，首先将其置于冰上解冻，然后在新的 1.5 毫升微量离心管中，向 1 微升退火终止子中加入 124 微升无核酸酶水。以 10,000×g 离心 30 秒。

离心后，将样品置于冰上保存。在新的适合的PCR仪管中，加入6 µL无核酸酶的水，然后加入1 µL商用DNA连接酶缓冲液。

所有后续步骤均需在冰上进行。接下来，加入1微升含有35至50纳克/微升的pGR blue目的质粒，1微升40纳摩尔的退火终止子，0.5微升商用高保真BSA1限制性内切酶，以及0.5微升商用DNA连接酶。将反应混合物在10,000×g离心120秒。

然后将离心管直接放入热循环仪中，并运行以下程序：在37°C下孵育1分钟，共20个循环，接着在16°C下孵育1分钟，然后在37°C下孵育15分钟，共1个循环。程序结束后，可将样品在20°C下冷冻保存，或立即进行转化。

使用任何合适的转化方案，将连接反应产物转入感受态 e. coli 细胞中。此处采用 zippy 转化法将连接产物转入 JM109 细胞。

使用L形玻璃涂布棒，将25微升转化后的细胞均匀涂布于预先温育的含有1毫摩尔氨苄青霉素和10毫摩尔阿拉伯糖的LB琼脂平板上。在37摄氏度下过夜培养平板，培养时间不得超过24小时。

氨苄青霉素降解迅速。第二天，观察菌落的颜色。成功的连接产物在可见光下应呈白色或黄色，在蓝光或紫外光下会发出绿色荧光。

连接失败将产生在可见光下呈蓝色的菌落。针对每个终止子和对照组，准备一个试管，其中含有5毫升无菌LB肉汤，添加1毫摩尔的氨苄青霉素和10毫摩尔的阿拉伯糖。在执行本方案时，使用pGR质粒时确保设置正确的对照组至关重要。

第一个对照应仅为 LB 肉汤。下一个对照应为具有氨苄青霉素抗性但在蓝光下不发荧光的细胞。这些将作为空白对照。

下一个对照是未被切割的 pGR 质粒，因此不含终止子，将作为终止子强度的基线；你所用试管中的最后一个则用于待测样品。在可见光下，用无菌接种环挑取 2 至 3 个白色或黄色菌落，并转移至 LB 液体培养基中。将样品置于摇床中，在 37°C、160 rpm 条件下振荡培养 16 至 18 小时。

第二天，使用分光光度计测定每个样品在 600 纳米处的光密度。通常，经过该培养时间后，OD 600 预期值为 0.8 至 1.0。将无菌的 96 孔板放入生物安全柜中。

对于每个样品或对照，准备3个含有199微升无菌LB肉汤（含氨苄青霉素和阿拉伯糖）的孔。接着，将过夜培养物中的细胞溶液各取1微升，分别加入96孔板的各个孔中。用透气封板膜覆盖板孔，然后在37摄氏度、160 rpm条件下振荡培养18至20小时。

第二天，使用酶标仪测定 OD 600，其值应约为 0.5。同时，在激发波长 395 纳米、发射波长 509 纳米的条件下测定 P 荧光的 G 值。在激发波长 575 纳米、发射波长 605 纳米的条件下测定 RFP 荧光。

使用 Excel，通过将荧光值除以 OD 600 来校正生长差异。归一化后，通过计算 GFP 终止子荧光值与 GFP 对照荧光值的比值，再除以 RFP 终止子荧光值与 RFP 对照荧光值的比值，来确定相对终止子强度。本视频中所描述的分析方法用于研究经生物信息学方法在微细菌噬菌体 bernal 13 中鉴定出的潜在终止子 T1 至 T6。

这些结果展示了相对荧光强度。所有结果均使用含有未切割、未修饰PGR的细胞作为对照进行归一化处理。T3被证实是一个强效终止子。

所有结果均代表在三个重复实验中生长的单个菌落，并对数据取平均值以进行可视化展示。误差线表示平均数据点之间的偏差。为了确定用于量化终止子强度的最佳参考对照，比较了使用原始 pGR 质粒（不含终止子）以及克隆了已知非终止子序列的 pGR blue 的原始数据。

如图所示，两个对照组均表现出相似水平的GFP和RFP表达，更重要的是，其GFP与RFP的比值也相近。所有这些结果均代表独立的菌落，每个样本均设置三个重复，取平均值用于可视化展示。一旦掌握该技术，包括样品运输和订购时间在内，整个过程最短仅需72小时。

需要注意的是，pGR blue 仅在大肠杆菌（e.coli）中有效。此外，由于我们仅观察了终止子的一小段序列，因此无法了解可能调控转录的其他调控元件。为了验证使用 pGR blue 协议所获得的结果，可采用其他方法进行验证，例如定量 PCR。

此外，pGR 插入片段可被切割下来并连接至您选择的质粒中。