利用类风湿关节炎患者关节中分离的成纤维样滑膜细胞生成诱导性多能干细胞

本实验的总体目标是从类风湿关节炎炎症关节的滑膜组织中分离出的成纤维样滑膜细胞诱导生成诱导性多能干细胞（iPSCs）。目前，iPSCs 可由多种人类原代细胞制备获得。我们已成功利用人类成纤维样滑膜细胞生成 iPSCs，这类细胞是类风湿关节中关键的病理细胞。

这有助于研究类风湿关节炎的病理机制。本期刊可帮助回答有关使用类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞（RA-FLSs）研究诱导多能干细胞（IPSCs）退变的关键问题。首先将滑膜组织置于100毫米培养皿中，并用5毫升添加了抗生素的磷酸盐缓冲液（PBS）清洗组织。

去除黄色脂肪组织和骨残留物。将修整后的组织转移至六孔板的一个孔中，孔内含有5毫升添加了FBS的DMEM培养基，用剪刀将组织剪碎，直至碎片足够小，能够通过一次性移液器吸头。将培养基转移至50毫升锥形管中，然后向孔中加入5毫升新鲜的含FBS的DMEM培养基，以收集任何残留的组织，并将孔内全部内容物转移至该锥形管中。

接下来，将冰上解冻的胶原酶加入离心管中，使其终浓度为0.01%，用封口膜密封后，在37摄氏度水浴中振荡孵育。四小时后，加入新鲜DMEM培养基（含FBS）至终体积为50毫升，通过离心收集组织碎片。小心移除上清液，避免扰动沉淀，然后将细胞重悬于40毫升新鲜培养基中，再次进行离心。

将第二次获得的沉淀重悬于25毫升新鲜DMEM加FBS中，静置使较大的组织团块沉降。随后将上清液转移至新的100毫米培养皿中，在37摄氏度、5% CO2条件下培养滑膜细胞14天。为扩增滑膜细胞培养物，弃去用过的培养基，并用5毫升PBS洗涤细胞。

吸去 PBS，加入 1 毫升 EDTA，在细胞培养孵箱中孵育 2 分钟以解离细胞。孵育结束后，轻轻敲击培养皿，使残留的贴壁细胞脱落，并将所得细胞悬液转移至 15 毫升锥形离心管中进行离心。将沉淀重悬于 30 毫升 DMEM 和 FBS 中，并将细胞分种至 3 个新的 100 毫米培养皿中。

每3天用新鲜培养基喂养滑膜细胞，在细胞融合度达到80%时，将细胞分种到3个新的培养体系中，方法如前所述。在转导第0天，将每孔3 × 10⁴个FLS接种于6孔板中，每孔加入新鲜生长培养基，在37°C、5% CO₂条件下过夜培养。次日，将一管含有4种Yamanaka因子的慢病毒在4°C条件下解冻，并将FLS培养基更换为添加了六亚甲基溴化铵和抗坏血酸的FLS生长培养基。

待冻存管内物质完全解冻后，向细胞中加入30微升慢病毒液，并轻轻混匀，使病毒均匀分布。为提高感染效率，将培养板离心后放回培养箱，并每天更换含有丁酸钠和抗坏血酸的新鲜FLS生长培养基，持续3天。第4天时，将培养基更换为含丁酸钠和抗坏血酸的FLS生长培养基与iPSC培养基的混合液。

第5天，将60微升的玻连蛋白加入6毫升不含钙和镁的PBS中，混匀后每孔加入2毫升该溶液，对6孔板中的3个孔进行包被，室温孵育至少1小时。在玻连蛋白孵育期间，用PBS洗涤转导后的细胞，并如所示用EDTA将其消化脱离。离心收集解离的细胞后，将细胞沉淀重悬于900微升新鲜培养基中。

吸去孔中多余的玻璃粘连蛋白，将300、150和100微升的细胞分别加入不同的孔中。然后将细胞放回培养箱，每天更换新鲜的iPSC培养基，直至克隆出现。挑选克隆时，首先在经玻璃粘连蛋白包被的48孔板的每孔中加入500微升iPSC培养基，并添加ROCK抑制剂。

然后，将 FLS 培养物置于洁净台内的解剖显微镜下，使用 10 微升移液器吸头围绕目标菌落进行切割。用 200 微升移液器吸头将挑取的菌落转移至 48 孔板中的一个孔内。待所有菌落均被挑取后，将该板放入细胞培养箱中孵育，直至菌落生长至适合转移的大小。

当细胞集落超出显微镜100倍放大下的可视视野时进行传代。在此图像中，可观察到初始培养14天后分离的滑膜成纤维样细胞（FLS）的形态。这些细胞总体上表现出成纤维细胞的特征，表达纤维化标志物波形蛋白（vimentin）和纤维连接蛋白（fibronectin），而类巨噬细胞型滑膜细胞标志物CD-68呈低表达。在Yamanaka因子慢病毒转导后8至11天，开始出现小的细胞集落，可将其挑取并扩增培养5至10代。

这些类风湿关节炎诱导多能干细胞表达碱性磷酸酶，表明其仍处于未分化状态。通过RT-PCR和免疫荧光分析证实，这些细胞还表达多能性标志物。核型分析显示，类风湿关节炎诱导多能干细胞具有正常的染色体核型44+XY。

此外，在注射到SCID小鼠体内12周后，类风湿关节炎来源的iPSC形成了畸胎瘤，表现出多种组织表型。其三胚层分化能力已通过免疫荧光染色得到证实。一旦掌握该技术，即可从滑膜来源的成纤维样滑膜细胞（FLSs）中生成iPSC。

观看视频后，您应能更好地理解如何从滑膜组织中分离细胞，以及如何利用这些细胞诱导重编程。这些由RAF-FLS衍生的iPSC可用于风湿病学领域的再生研究或药物筛选。一旦建立这些iPSC，便可生成多种类型的靶细胞或器官。

这可能有助于研究该疾病或其他未来应用，例如基因编辑等。