基于影像引导的激光制造血管衍生微流体网络

本实验方案的总体目标是介绍如何使用配备飞秒脉冲激光器的共聚焦显微镜，通过基于图像引导的激光降解技术，在聚乙二醇二丙烯酸酯水凝胶中构建三维血管仿生微流控网络。该技术的一个显著优势在于能够生成精确再现体内血管系统密度、迂曲度、尺寸范围及整体结构特征的三维仿生微流控网络。这种微流控结构制备方法将有助于提升我们构建更接近体内环境的组织工程结构、仿生疾病模型以及超高密度芯片器件的能力。

该方法的可视化演示至关重要，因为显微镜软件的正确设置与操作并不直观，但对于形成目标微流控网络却极为关键。许多 preparatory 步骤已在文本方案中涵盖，包括生成虚拟掩模、配置显微镜以及将虚拟掩模上传至显微镜软件。为实现 PEGDA 水凝胶的光聚合，首先将一圈双面胶粘附到一个底部切有 20 毫米孔洞的 60 毫米培养皿上。

接下来，在通风橱中，将 1 毫升含 TEOA 的 HBS 加入用铝箔包裹的 2 毫升棕色离心管中。然后，向该管中加入 10 微升 1 毫摩尔的伊红 Y 二钠盐。现在，使用玻璃移液管将少量 NVP 移入玻璃烧杯中。

从该体积中取 3.5 µL 的 NVP，并将其转移至混合物中。接着，将 10 mg 的 3.4 kDa PEGDA 加入另一个覆有铝箔的试管中。然后，加入 0.2 mL 的混合物，制成 5% (w/v) 的 PEGDA 预聚体溶液。

现在，涡旋预聚物溶液直至 PEGDA 完全溶解。然后，用移液器吸取 60 微升该溶液，滴加到 PDMS 模具上，注意避免引入气泡。接着，将一块经丙烯酸化处理的 40 毫米直径、1.5 号玻璃盖玻片置于 PDMS 间隔层上的溶液中央位置。

然后将组装件置于校准为输出95毫瓦的白光光源下，使聚合物固化三分钟。接着，在模具与盖玻片之间通入蒸馏水，使水凝胶与PDMS分离，并冲洗掉水凝胶。

然后，小心地将盖玻片边缘轻轻拍干，注意不要从水凝胶中吸走水分。现在将盖玻片粘附到已准备好的培养皿上，稍加压力有助于粘合。

然后，将水凝胶浸入蒸馏水中。按照文本方案中的描述设置激光扫描共聚焦显微镜，并启动水凝胶可视化配置。接着，将水凝胶和培养皿安装到载物台插件中，并将其放置在载物台上。

接下来，向培养皿中加入至少五毫升蒸馏水，并将水浸物镜降至接近水凝胶上方但不与之接触的位置。然后，点击“live”以开启氩离子激光线。随后，对水凝胶进行聚焦，直至在水凝胶的上表面观察到伊红Y信号为止。

为帮助定位水凝胶，可尝试暂时提高功率百分比或针孔尺寸。标记水凝胶顶部和底部以及孔底部的位置，然后使用操纵杆横向移动，找到孔的边缘。

在焦点窗口中，使用 Z 位置框旁边的向下箭头，将焦平面在水凝胶内向下移动 150 微米。下一步至关重要。在载物台窗口中将 X 和 Y 位置归零，然后删除所有其他标记位置，仅保留归零后的位置标记。

现在，开始形成入口通道的过程：首先拍摄图像，然后在区域窗口中使用矩形按钮勾勒出将作为血管网络入口的区域。接着进入通道形成配置。具体细节请参见文本方案。

到达该位置后，在Z轴堆叠窗口中，单击顶部和偏移量上方的居中按钮，以将Z轴堆叠当前定位至居中位置。然后根据入口所需大小，以1为间隔设置切片数量。接着，确认扫描速度已设置为3，功率百分比已设置为100%。

然后保存配置并点击开始实验按钮。在通道降解过程中，若视野中的区域呈黑色，可增加通道窗口中的主增益；若区域呈白色，则降低主增益，以实现水凝胶的可视化。降解完成后，返回水凝胶可视化配置并点击实时（live），确认入口已形成。

首先，在“区域”窗口中，加载虚拟掩膜Z轴序列中的任意一个ovl文件，然后点击箭头按钮以在视野中查看感兴趣区域（ROI）。接着，点击“实时”以扫描水凝胶可视化配置，并使用操纵杆或载物台窗口将水凝胶定位，使入口与血管网络内的正确位置相连接。随后，在聚焦窗口中，使用设定的步长并点击向下箭头，将焦平面移至显微镜宏中定义的第一个位置，即从先前居中的Z位置向下50微米处。

同样，现在必须重新将 X 和 Y 位置归零，删除所有其他已标记的位置，并仅将此位置标记为新的零点。务必保存此新配置。现在，在通道形成配置下，仅选择时间序列和漂白窗口。

接下来，打开宏并选择保存选项卡。选择先前创建的配方，然后单击应用。注意不要单击存储，否则该配方将被覆盖。

确认设置后，再次保存通道形成配置，然后点击显微镜宏中的“更新”。点击“否”以保留当前位置列表，不进行覆盖，随后点击显微镜宏中的“开始”以启动程序。降解过程完成后，使用较低激光功率的水凝胶可视化配置，以便观察FITC标记的葡聚糖，其信号亮度高于水凝胶中天然的伊红Y信号。

在引入荧光标记的葡聚糖之前，用吸水材料从水凝胶的孔中吸去部分水分。然后加入10 µL过滤后的FITC标记葡聚糖溶液。该方法用于将大量微血管图像转化为一系列虚拟掩膜，以指导微流控网络的构建。

将所得到的微流控网络与其来源的体内血管系统进行了比较。基于图像引导的激光水凝胶降解技术实现了三维仿生微流控网络的构建，该网络可重现体内血管系统的尺寸、迂曲度及复杂结构。通过压力头和注射泵两种方式驱动嵌入式微流控网络中的流体流动。

通过压力差驱动的流动，观察到荧光标记的70千道尔顿葡聚糖和10微米聚苯乙烯微球从左向右移动。或者，通过在次级微流控装置内光聚合水凝胶来启动由注射泵驱动的流动。采用此处所述的相同方案，随后利用激光降解技术在封装的水凝胶中构建二维血管衍生网络，用于注射泵驱动的流动以及65千道尔顿葡聚糖的灌注。

观看本视频后，您应能够充分理解如何使用配备飞秒脉冲激光器的激光扫描共聚焦显微镜，通过基于图像引导的激光降解水凝胶方法来构建仿生微流体网络。一旦掌握该技术，若操作得当，可在两到三小时内完成实验。在实施该实验过程中，需特别注意：激光参数（包括功率、波长和扫描速度）应根据所用水凝胶的配方进行调整和优化。

感谢您，祝您的实验顺利。