检测细菌芽孢萌发过程中的皮层碎片

本逐步实验方案的总体目标是在细菌芽孢萌发过程中定量检测皮层片段或还原糖的含量。该方法将详细说明在芽孢萌发过程中检测皮层片段或还原糖存在的各个步骤。该技术的主要优势在于大多数实验室均具备成功完成该方案所需的试剂和设备。

开始此操作时，将一管艰难梭菌芽孢置于加热块中，在65摄氏度孵育30分钟。孵育结束后，将试管放在冰上。萌发液的配方取决于所研究的细菌芽孢种类。

为了检测艰难梭菌芽孢的萌发，我们使用含有10毫摩尔 Tris（pH 7.5）、150毫摩尔氯化钠、100毫摩尔甘氨酸和10毫摩尔牛磺胆酸的去离子水溶液。每个样品准备1毫升萌发溶液，并额外多准备1毫升。在开始检测前，将1毫升萌发溶液转移至微量离心管中，并放置一旁备用。

这将作为皮层碎片检测的空白对照。接下来，向萌发溶液中加入孢子，使 OD600 约为 3.0，并短暂涡旋。该浓度的孢子有助于在艰难梭菌孢子萌发过程中适度释放皮层碎片。

加入孢子后立即取1.2毫升样品至新的微量离心管中，并放入离心机。然后在室温下以14,000 × g离心一分钟。此为零时间点。离心后，将一毫升上清液转移至新的2毫升螺旋盖管中，并于-80°C冷冻保存。

以固定时间间隔重复取样、离心和冷冻的操作，直至每个时间点的样品均被收集完毕。由于离心和取样所需时间，本实验无法实现短于两分钟的时间点，因此样品每两分钟采集一次，共采集14分钟。在制备皮质样品过程中，若需监测吡啶二羧酸，应另取100微升样品并分装至预冷的微量离心管中，置于冰上。

同时准备含有以下量的N-乙酰葡萄糖胺的标准曲线样品：0、12.5、25、50、100、250、500和5,000 纳摩尔，溶于萌发溶液中。每个时间点的样品采集完成后，将样品从冷冻环境中取出，并与空白样品及标准曲线样品一同进行冻干处理。

然后将所有样品于 -80 °C 保存，直至使用。在检测当天，用 120 µL 含苯酚和β-巯基乙醇的盐酸溶液重悬冻干样品，包括对照品和标准曲线样品。接着，将所有重悬后的样品转移至新的 2 mL 螺口离心管中。

然后将它们置于95摄氏度的循环水浴中孵育4小时。孵育结束后，将样品置于冰上直至冷却。随后加入120微升3摩尔的氢氧化钠以中和样品。

接下来，向每个样品中加入80 µL饱和碳酸氢钠溶液和80 µL 5%乙酸酐溶液，涡旋混匀。然后在室温下孵育样品10分钟。孵育结束后，将样品重新转移至95 °C水浴中，准确加热3分钟。

请注意，此步骤对时间敏感，时间过长可能影响后续信号的产生。将样品从水浴中取出，并在冰上冷却。向每根试管中加入 400 µL 的 6.54% 四硼酸钾四水合物，然后涡旋混匀。

将样品放入循环水浴中，在 95 摄氏度下准确孵育七分钟。此步骤对时间敏感。孵育结束后立即取出样品，置于冰上冷却五分钟。

在样品置于冰上的同时，配制显色试剂。将 0.320 克二甲基对氨基苯甲醛（DMAB）溶解于 1.9 毫升冰醋酸中。注意该试剂对时间、温度和光线敏感，不应提前配制。

待DMAB完全溶解后，加入100 µL 10 N盐酸并涡旋混匀样品。然后加入5 mL冰醋酸，再次涡旋混匀。进行比色反应时，将每份冷却后的皮质样品或对照样品各100 µL转移至新的1.5 mL微量离心管中。

向每个样品中加入700微升 freshly prepared color solution。立即将样品转移至37摄氏度水浴中，并准确孵育20分钟。孵育结束后，将每个样品中的200微升转移至透明的96孔板中。

样品初始应呈黄色，但如果存在还原糖（表明皮质存在），颜色将变为紫色。此处，许多样品未显示出明显的紫色。然而，250、500 和 5,000 纳摩尔的样品在视觉上与零纳摩尔的阴性对照有所不同。

使用酶标仪测定585纳米处的吸光度。在585纳米光密度下测得的标准样品信号最符合线性回归。下表显示了使用N-乙酰葡萄糖胺标准品的典型结果。

随后利用这些数据生成了此处所示的标准曲线。在促进萌发的条件下进行萌发实验，萌发缓冲液中添加100毫摩尔甘氨酸和10毫摩尔牛磺胆酸；在非萌发条件下，仅添加100毫摩尔甘氨酸。

在缺乏牛磺胆酸的情况下，艰难梭菌孢子不会萌发，溶液中皮层碎片的存在量几乎没有变化。然而，在同时存在牛磺胆酸和甘氨酸的情况下，艰难梭菌孢子会萌发并将皮层碎片释放到溶液中。这表现为反应样品在585 nm处的光密度（OD585）随时间逐渐增加。

本实验中释放的皮层碎片数量通过标准曲线计算得出。从本实验结果可以看出，在萌发剂处理后15分钟内，大部分皮层已被水解或释放，这表明在此时间段内大多数孢子已经萌发。

观看本视频后，您应能够充分理解如何在细菌芽孢萌发过程中检测萌发液中的皮层碎片或还原糖。在进行该实验操作时，需特别注意反应时间，以确保检测反应能够正确进行。