利用微呼吸分析和显微解剖技术研究冬孢子萌发

本方案的总体目标是确定孢子萌发的各个阶段，以便评估基因转录水平。对这些变化的分析将有助于进一步了解病害传播过程中的一个关键阶段。该方法可帮助解答有关担孢子萌发过程中与基因转录水平变化相关的关键问题，从而反映基因表达调控的转变。

该技术的主要优势在于，能够识别呼吸水平的变化，而这些变化并不对应于可见的形态学转变，同时允许在不同萌发阶段对冬孢子进行物理分离。该技术对病原体传播的控制具有重要意义，因为它使我们能够识别孢子萌发过程中的关键转变，若能干预这些转变，则有可能阻断疾病的扩散。本实验操作应从玉米穗感染、冬孢子收获，以及冬孢子活力和萌发测试开始，具体步骤如文本方案中所述。

为诱导萌发，首先为每个呼吸实验称取等量的冬孢子。在生物安全柜中，将冬孢子加入已灭菌的呼吸室中。用马铃薯葡萄糖肉汤填充呼吸室，并添加硫酸链霉素和硫酸卡那霉素。

通过上下吹打形成冬孢子悬浮液。将腔室盖盖在腔室上，形成密闭的气密密封。为获得OCR测量值，首先将腔室放入水浴内腔室架中。

然后，将氧气探头放入腔室的开口内。在传感器实时追踪程序中监测出现的数据点。探头放入腔室后，使其稳定约三分钟。

单击“测量”以连续六小时测量氧气水平，每两秒记录一次数据。停止测量，并对每个待分析的样品重复上述步骤，然后将数据导出至 Microsoft Excel，并按照文本方案中所述进行数据分析。取约 10 毫克的玉米黑粉菌冬孢子放入 1.5 毫升微量离心管中。

将冬孢子悬浮于500 µL添加了硫酸链霉素的PDB培养基中。轻轻吹打混匀，直至培养基中无冬孢子团块。将冬孢子悬浮液转移至已灭菌的250 mL锥形瓶中，瓶内含有添加了硫酸链霉素的PDB培养基。

将锥形瓶在28摄氏度下振荡培养过夜，转速为90 RPM。取一个培养皿，用移液器在培养皿顶部加入四到五个5 µL的蒸馏水液滴。然后，在培养皿中加入三个2 µL的RNA稳定液液滴，用于样品采集。

同时用移液器将30个5微升的萌发黑粉孢子液滴加入培养皿中。向培养皿中加入15毫升矿物油。继续操作前，确保所有液滴均被油覆盖。

接下来，准备一根内径为15微米、法兰直径为1毫米、长度为55毫米、尖端角度为20度的微毛细管。将其放入微毛细管固定装置中，并浸入矿物油中，通过毛细作用使矿物油进入微毛细管内部。在将微毛细管移至水滴之前，释放其内部压力。

吸液以用水准备显微毛细管。利用显微操作仪的控制装置，将制备好的显微毛细管移至其中一个萌发液滴，并插入液滴中。降低显微毛细管，使其管口接近处于目标萌发阶段的萌发性冬孢子。

缓慢吸液，以捕获萌发的冬孢子。一旦冬孢子进入微毛细管，即停止吸液。重复此操作，直至微毛细管中约有五个冬孢子。

使用显微操作器将微毛细管抬起，并移至RNA稳定溶液的收集液滴中。穿入液滴后，将冬孢子注入该液滴内。重复上述步骤，直至捕获约1,000个冬孢子。

为了回收收集液滴，用移液器将收集液滴吸起，并转移至无RNA酶和DNA酶的2.0毫升微量离心管盖中。小心用移液器去除矿物油，注意不要扰动收集液滴。此时，冬孢子可用于后续实验操作，如RNA提取。

该图展示了诱导冬孢子悬浮液萌发后测定氧浓度变化的典型结果。与未诱导的冬孢子相比，指示呼吸作用开始的分离现象出现在约30分钟时。考虑到设置实验并运送样品至氧探头大约需要15分钟，因此实际起始时间为45分钟。

此处展示的是担孢子萌发的五个阶段。在第一阶段，担孢子被诱导萌发，但尚未表现出任何形态学上的萌发迹象。第二阶段的担孢子显示出萌发管（原菌丝）开始伸出，其长度小于担孢子的直径。

第三阶段，先菌丝的长度大于冬孢子的直径。第四阶段的特征是先菌丝上附着担孢子。第五阶段则出现出芽的担孢子。

此处展示了异步萌发的冬孢子，微毛细管被置于一个三阶段冬孢子附近。随后将三阶段冬孢子吸入微毛细管中，并转移至一滴收集液中。一旦掌握该显微分离技术，可在六到七小时内分离出 1,000 个特定阶段的冬孢子。

在进行该实验操作时，重要的是要记得经常休息。观看本视频后，您应能够充分理解如何在形态学上不同的萌发阶段对孢子进行物理分离，并确定呼吸作用启动的时间。

通常，初次接触该方法的研究人员会面临困难，因为需要保持无菌操作，同时需要耐心并通过显微解剖技术分离特定细胞类型。该技术的发展为真菌植物病理学家研究严重威胁全球粮食安全的黑粉菌和锈菌在萌发过程中的形态学和分子机制铺平了道路。

尽管该技术适用于我们这些韧皮部病原体研究者，但它也可用于许多其他造成严重农业作物病害的病原体，这些病原体每年导致数十亿美元的经济损失。在完成本实验步骤后，可进一步开展RNA提取等其他方法，以回答更多科学问题，例如：转录水平变化的特征及其发生时间是怎样的？