细菌芽孢萌发过程中皮层降解的比色法检测

0 次观看3:05 分钟 • September 26th, 2025

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细菌芽孢由于含有肽聚糖皮层结构而保持休眠状态,该皮层是由糖类和氨基酸组成的聚合物。

在萌发过程中,皮层降解并释放糖类到周围培养基中。

为了检测皮层降解,首先取在孢子萌发过程中特定时间点收集的含有释放糖类的培养基。

使用浓度递增的糖标准品作为参照。

标准品和样品需经过预处理,以将糖类转化为反应性形式。

使用 Ehrlich 试剂孵育,该试剂是一种比色检测试剂,可与糖类反应并形成紫色复合物。

将混合物转移至多孔板中,使用酶标仪测定有色复合物的吸光度。

吸光度对应于紫色的深浅,其与糖浓度成正比。

不同时间点样本的吸光度增加表明皮质逐渐降解。

根据标准品浓度绘制标准曲线,并定量样品浓度。

在样品置于冰上的同时,配制显色试剂。将 0.320 克二甲基对氨基苯甲醛(DMAB)溶解于 1.9 毫升冰醋酸中。注意该试剂对时间、温度和光线敏感,不应提前配制。

待DMAB完全溶解后,加入100 µL 10 N盐酸并涡旋混匀样品。然后加入5 mL冰醋酸,再次涡旋混匀。进行比色反应时,将每份冷却后的皮质样品或对照样品各100 µL转移至新的1.5 mL微量离心管中。

向每个样品中加入700微升 freshly prepared color solution。立即将样品转移至37摄氏度水浴中,准确孵育20分钟。孵育结束后,将每个样品中的200微升转移至透明的96孔板中。

样品初始应呈黄色,但如果存在还原糖(表明皮质存在),颜色将变为紫色。在此,许多样品未显示出明显的紫色。然而,250、500 和 5,000 纳摩尔的样品在视觉上与阴性对照(0 纳摩尔)存在差异。

使用酶标仪测定585纳米处的吸光度。在585纳米光密度下测得的标准样品信号最符合线性回归。

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最后更新:22 八月 2026