链霉菌发育突变体的宏观与显微观察

以下技术的总体目标是在大学教学实验室和高中课堂环境中，培训初学者掌握链霉菌及其他相关物种的实验操作。对于众多刚进入链霉菌研究领域的科研人员而言，表型观察具有重要意义。本视频介绍了细菌的扩增、保存以及肉眼和显微镜检查的方法。

本文所述的表型分析方法以天蓝色链霉菌（Streptomyces coelicolor）为模型。然而，这些方法同样适用于链霉菌属的其他成员以及亲缘关系相近的放线菌（Actinomyces）。这些技术的主要优势在于，其设计兼顾了可及性，既适合高中课堂或本科教学实验室中的初学者，也适用于经验丰富的实验人员。

观看本视频并阅读配套的实验方案后，新研究人员应能够操作其链霉菌菌株，正确保存菌株，并开始进行表型特征观察实验。本视频中的操作演示由来自奥特拜因大学实验室的本科研究学生加勒特·卡德尔（Garret Kandell）和肖恩·柯克（Sean Kirk）完成。首先，采用标准方法（例如 Saunders 2012 中演示的四区划线法），将链霉菌菌株划线接种至 MS 琼脂平板上，培养至形成单菌落。

每四到六天挑取单个菌落，并重新划线接种至新鲜培养板上。随着菌落老化，其发生随机突变的可能性增加。按照文本所述方案完成诱变处理后，记录各突变株与野生型亲本菌株相比的菌落形态特征。

在鉴定新的链霉菌（Streptomyces）物种时，应将新分离的菌株与已深入研究的物种进行比较，观察其基本形态、菌落表面特征、不透明度、隆起程度及色素产生情况。标记一个MS琼脂平板，以楔形模式划线接种野生型和突变型菌株。注意确保各菌株之间互不接触，以避免交叉污染。

记录菌株划线接种到平板上的日期和时间。随后将平板在30摄氏度条件下进行培养。请注意，始终保护您的链霉菌样品免受污染至关重要。

所有打开培养皿和试管的操作步骤均需采用最佳的无菌技术，并尽量缩短暴露时间。将培养后的培养皿放置在彩色或白色纸张上，以使背景均匀。在纸上注明菌株名称、日期、培养温度以及首次划线接种后的时间。

在纸张背景上写下菌株信息后，对培养皿进行数码拍照，以尽量减少混淆。用70%乙醇清洗镊子，然后通过本生灯火焰灼烧以蒸发乙醇，从而对镊子进行灭菌。用70%乙醇清洗盖玻片，随后将其置于无菌培养皿中晾干，以实现灭菌。

接下来，为了制备细菌生长的盖玻片样本，使用无菌镊子夹取一片无菌盖玻片，将其放置在细菌生长密集的MS琼脂平板上。用镊子轻轻按压盖玻片背面，以确保有足够量的细菌孢子和气生菌丝被转移。从平板上取下盖玻片，将其以45度角放置，使带有细胞材料的一面朝向载玻片表面，载玻片上已加有一滴15 µL的50%甘油溶液。

让盖玻片自然下落至甘油上，以减少气泡产生。若需在不同时间点进行相差显微镜观察，将制备好的玻片置于显微镜载物台上，并在盖玻片中央滴加一滴镜油。旋转至100倍相差物镜位置，并将聚光镜转盘调整至相应的匹配相差档位。

当物镜与镜油接触后，仅使用细调焦旋钮来聚焦图像。应观察多个视野，以辨别突变株与野生型之间明显且一致的差异，例如形成孢子的能力、孢子的大小和形状以及孢子的总体数量。

使用无菌镊子，从观察到明显细菌生长的 MS 琼脂平板上制备盖玻片印迹，操作方法同前，用镊子轻轻触碰盖玻片背面，以确保有足够量的细菌孢子和气生菌丝被转移。将盖玻片从平板上取下，放置在卡纸上，使带有细胞材料的一面朝上，以便于后续操作和处理。用预冷的甲醇浸没盖玻片，静置五分钟。

用 PBS 轻轻地加液并移除溶液，清洗盖玻片两次。向载玻片上加入 15 微升浓度为 10 微克/毫升的碘化丙啶溶液和/或 10 微克/毫升的 WGA-FITC。将盖玻片正面朝下放置于一滴荧光染料上。

将样品置于避光或光线较暗的环境中孵育15分钟。荧光染料的储备液及染色样品均应避光保存。建议研究人员在样品制备过程中采用低光照条件，并在样品制备完成后使用暗盒存放样品。

使用配备碘化丙啶和FITC落射荧光激发滤光片的相差或微分干涉差（DIC）显微镜，通过100倍物镜观察载玻片。根据正文实验方案分析图像。图中所示为转座子诱变产生的链霉菌突变体示例。

较浅色的气生菌丝可能表明由于孢子形成缺陷导致灰色色素水平较低。或者，缺乏绒毛状外观则提示气生菌丝形成受阻。通过相差显微镜观察可见，野生型 S.coelicolor 菌落在培养约两天后通常会产生气生菌丝。

经过三天生长后形成长串的孢子。白色突变体可能表现为孢子形成延迟，产生孢子的数量减少，产生的孢子存在形态和/或大小缺陷，或者仅产生较低水平的成熟灰色孢子色素。此处通过微分干涉相差显微镜（DIC）和PI染色的荧光显微镜观察显示，野生型样品中孢子链呈现规律间隔的染色模式，而两个转座子插入突变体由于存在染色体分离缺陷，其染色模式则呈间断分布。

使用WGA-FITC染色细胞壁后，野生型菌株S.venezuelae呈现为光滑的气生菌丝，其间分布着成链的孢子，并表现出典型的孢子形成过程中所见的侧向排列的隔膜结构。与丝状生物体的操作与常见的杆状细菌的操作有很大不同。

本视频方案应为初涉链霉菌研究领域的研究人员提供重要的资源。观看本视频后，您将能够充分了解如何开始研究链霉菌及其他相关细菌。在完成这些初步实验之后，可在研究实验室中采用多种技术，进一步深入了解您的链霉菌菌株。

例如，一些高级技术可能包括蛋白质标记或基因表达分析，如实时 PCR 和 RNA 测序。初步的表型实验用于鉴定和表征新菌株，并明确特定基因的典型功能。这些方法已在大学教学实验室中被用于鉴定和表征多种链霉菌菌株。