用于递送肝素结合域成骨生长因子的聚电解质复合物

本实验的总体目标是制备一种聚电解质复合壳层，该载体能够包埋并调控具有肝素结合结构域的多种生长因子的释放。该方法可为骨科组织工程领域中高效包埋与递送特定生长因子的关键问题提供解答。

该技术的主要优点在于通常无需使用有机溶剂，而有机溶剂已知会影响生长因子的生物活性。将200毫克未辐照的海藻酸钠或400毫克八兆拉德辐照的海藻酸钠溶解于10毫升双蒸水中。

然后振荡一小时。将海藻酸钠溶液在4°C下保存过夜。在制备海藻酸钠微珠前，使用无菌的0.2微米注射器滤器过滤海藻酸钠溶液。

用70%乙醇对静电纺丝发生器和注射泵进行消毒，并将其置于二级生物安全柜中。然后在静电纺丝发生器内放置一个带有磁力搅拌子的玻璃烧杯。将静电纺丝发生器的电极臂设置在烧杯上方9厘米处。

将BE发生器的电极电缆连接到臂电极的神经螺钉二。然后向盆中倒入80毫升氯化锶溶液。接下来，将5毫升经0.2微米滤膜过滤的海藻酸钠溶液装入橡胶管的注射器中。

将橡胶管连接至手臂电极后，以每小时5毫升的速度启动注射泵，持续2分钟，以排出管路内的空气并将海藻酸钠溶液输送至喷嘴尖端。

然后，关闭注射泵。开始微珠生成时，将封装仪设置为5.8千伏，随后启动注射泵，使海藻酸钠的流速为每小时5毫升。

弃去前两分钟内生成的微珠，因为这些微珠通常大小和形状不规则。将后续生成的微珠收集至0.2摩尔的氯化锶溶液中。随后关闭注射泵，再关闭包埋装置。

注入预定体积的海藻酸钠溶液后，对后续批次的微珠制备重复此操作。将微珠置于20毫升0.2摩尔的氯化锶溶液中，在4摄氏度下保存过夜，以完成交联并稳定凝胶。

用塑料移液管收集 0.5 毫升海藻酸盐微珠，将其置于载玻片上，在光学显微镜下以 10 倍放大倍数观察微珠。

使用显微镜CCD相机拍摄10张微珠的图像。以TIFF格式保存图像，分辨率设置为2048 × 1536，并添加500微米的比例尺。使用ImageJ中的长度测量工具，测量微珠的尺寸。

以及比例尺。然后将微珠的长度从像素转换为微米。点击线条工具，在海藻酸盐微珠的中部画一条线。

单击菜单栏上的“analyze”，然后选择“measure”。此时将弹出一个窗口。重复这些步骤，以测量图像内所有的海藻酸盐微珠。

测量图像上的比例尺。使用100微米尼龙滤网收集微珠，并用双蒸水洗涤微珠。

使用刮刀将由 0.1 毫升海藻酸钠溶液制备的全部微珠转移至一个 2 毫升微量离心管中，并用纱布覆盖以防止干燥。最后，按照制造商的说明，通过液体模式高压灭菌或相应方法对微珠进行灭菌。向腔室中加入 1.5 升蒸馏水，以防止微珠干燥。

在生物安全二级（BSL2）生物安全柜内，将无菌微珠与一毫升灭菌的、浓度为每毫升二毫克的鱼精蛋白溶液在室温下孵育一小时。用双蒸水将包被鱼精蛋白的微珠洗涤两次。然后使用台式离心机在室温下以200 × g离心三分钟，沉淀微珠。

离心后，使用注射器吸除上清液。将鱼精蛋白包被的微珠与1毫升灭菌的0.5毫克/毫升肝素溶液在30分钟内孵育。这将形成一种聚电解质复合物壳层，对肝素结合性生长因子具有强亲和力。

孵育后，使用注射器吸除肝素。用双蒸水洗涤两次，去除聚电解质复合物上未结合的肝素。将13.3 µL浓度为1.5 mg/mL的骨形态发生蛋白2（bone morphogenetic protein 2）或NELL样分子1（NELL like molecule 1）溶液加入到100 µg聚电解质复合物中。

将聚电解质复合物在4°C、30 RPM条件下振荡孵育10小时。随后，将微珠浸入1毫升磷酸盐缓冲液（PBS）中，在37°C下持续振荡。在第1、3、6、10和14天时，收集1毫升上清液，并补充1毫升PBS。

根据制造商提供的说明书，使用CBQCA蛋白检测法评估NELL样分子一的摄取和释放效率。也可选择进行ELISA检测。通过测定从聚电解质复合物中释放的NELL样分子一增强兔骨髓间充质干细胞碱性磷酸酶表达的能力，评估其生物活性。

在24孔板中每孔接种20,000个兔骨髓干细胞，加入1毫升含10%胎牛血清的杜氏改良伊格尔培养基，在37摄氏度、5% CO2条件下培养1天。24小时后，弃去原培养基，每孔更换为1毫升成骨诱导培养基，在37摄氏度条件下继续培养7天。

以及5% CO₂。将300微克的聚电解质复合物和聚电解质复合物NELL样分子1置于细胞培养小室中，以使复合物与细胞分离。将小室放入24孔板中，以避免在更换成骨诱导培养基时聚电解质复合物微珠被冲走。

每三天一次，将针头置于小室外部，吸出一毫升成骨诱导培养基，并加入一毫升新鲜的成骨诱导培养基。培养7天和14天后，使用碱性磷酸酶检测试剂盒检测碱性磷酸酶活性。

根据试剂盒制造商的说明书，将聚电解质复合物装入可生物降解的医用级聚己内酯-三钙磷酸盐支架的孔隙中。在BSL2级生物安全柜内使用无菌刮铲进行操作。

将1.5毫克或1.5毫升的骨形态发生蛋白2或NELL样分子1溶液加入含有聚电解质复合物的支架中，并在4摄氏度下孵育过夜。在显微镜下观察海藻酸盐微球，以监测其大小和形态。

未辐照的海藻酸盐微珠呈球形，而经辐照的微珠呈泪滴状。尺寸分布是影响生长因子摄取的重要因素，尺寸减小会增加表面积与体积之比。

使用 ImageJ 软件测量海藻酸盐微珠时，统计约 100 个微珠可对每批次微珠的粒径分布提供良好的估算。由于生长因子的摄取依赖于正确的包被技术，因此通过共聚焦显微镜观察每一层包被的厚度。此处展示了用鱼精蛋白、肝素、NELL 样分子 1 和骨形态发生蛋白 2 的荧光类似物孵育后的海藻酸盐微珠的共聚焦激光扫描显微镜图像。

碱性磷酸酶活性用于测定释放的生长因子的生物活性。在第14天与聚电解质复合物NELL样分子一孵育后，观察到碱性磷酸酶活性增加了2.2倍。一旦掌握，若操作得当，该技术可在五小时内完成。

进行此操作时，需注意海藻酸盐浓度会影响微珠的稳定性。对于经辐照的海藻酸盐，我们需要使用4%的浓度；对于未经辐照的海藻酸盐，则需要使用2%的浓度。

通过该方法，我们可以通过多层包覆进一步提高生长因子的负载量。该技术可使组织工程领域的研究人员探索生长因子在其他疾病模型中的递送应用。观看本视频后，您将能够制备粒径分布均一的聚电解质复合物。