采用自组装单分子层方法将BMP-2共价结合至表面

本实验的总体目标是将 BMP-2 分子共价结合到表面，同时不丧失其生物活性。该目标首先通过物理气相沉积法在基底上形成一层金膜来实现。第二步是构建一层自组装的双功能 NHS-硫醇连接分子 mu NHSA 单分子层。

接下来，将重组人BMP-2（RH BMP two）共价结合到连接子上。最后一步是通过超声处理去除未结合的BMP-2。最终，采用抗体结合实验验证BMP-2成功结合至表面，并通过分析细胞中SMAD1/5/8的磷酸化水平来确定表面结合的BMP-2的生物学活性。

该方法有助于解答生长因子生物学领域中的关键问题，例如生长因子在细胞表面与其受体的初始结合是否足以触发信号转导反应。演示本实验步骤的将是我实验室的两名成员，Teresa Paul 和 Elizabeth Schwab。开始此操作前，先用精密擦拭纸清洁玻璃盖玻片，然后将其在乙酸乙酯与甲醇按1:1比例配制的混合液中超声处理五分钟。

超声处理后，用甲醇冲洗基底，并在氮气流下吹干。将清洁的基底放入溅射镀膜设备中，抽真空。通过溅射60秒去除铬靶材最上层的氧化铬层。

然后在基底上镀一层10纳米的铬层，接着再镀一层40纳米的金层。完成后，将金基底从腔室中取出并放置一旁。将金基底转移至一个双颈圆底烧瓶中，在氮气氛围下，用1毫摩尔的M-U-N-H-S DMF溶液于室温孵育4小时。

孵育后，将底物在DMF中超声处理两分钟。用DMF和甲醇冲洗，并在氮气流下干燥。用含1摩尔氯化钠的PBS缓冲液稀释RHB MP two储备液，使其终浓度为每毫升3.5微克。

使用无菌的10毫摩尔氢氧化钾在使用前立即调节该工作液至pH 8.5。将A-P-D-M-S环置于样品上方。将基底转移至六孔板中，以确保仅有基底表面暴露于孵育溶液中。

然后将功能化的 M-U-N-H-S 基底与 RHB MP 二抗工作液在 4 摄氏度下孵育过夜。去除孵育后的上清液后，加入含 1 M 氯化钠的 PBS 溶液，并将基底超声处理 2 分钟。完成后，用含 1 M 氯化钠的无菌 PBS 溶液洗涤基底三次，以阻断抗体的非特异性吸附。

将底物在含5% BSA的PBS中室温孵育1小时。随后，将底物与抗BMP二抗溶液在室温下孵育1小时；孵育结束后，用PBS洗涤底物两次，并超声处理30秒。接着，将底物在HRP标记的二抗溶液中室温孵育30分钟，然后用PBS洗涤两次。

使用Ampliflu红色检测试剂，在酶标仪上于570纳米处测定HRP的酶活性。在六孔板中，以每孔1×10⁵个C2C12成肌细胞的密度接种于生长培养基中，并在37°C和5% CO₂条件下培养24小时。待培养板从培养箱中取出后，吸除各孔中的培养基，并在接种至功能化的BMP-2底物表面以研究短期信号诱导之前，用无血清DMEM对细胞饥饿处理3至5小时。随后，更换为200微升新鲜的无血清DMEM，并使用细尖镊子将固定化的BMP-2底物置于细胞上方，在37°C和5% CO₂条件下继续孵育。

轻柔地移除基质，并用移液器吸去培养基。随后用 PBS 清洗细胞两次，然后通过凝胶电泳和蛋白质印迹法分析细胞反应，以检测长期生物学活性。将细胞按先前所述方法接种到表面，并在 37 摄氏度、5%CO2 条件下，使用含 2%FBS 的培养基培养六天。

孵育后，通过荧光显微镜观察细胞，以验证RH BMP2的结合表面。将固定化RH BMP2的表面与BMP2特异性抗体及HRP标记的二抗共同孵育。在细胞刺激前后分别检测表面固定的RH BMP2或I BMP2。

图中显示了重组人骨形态发生蛋白2（RH BMP two）成功结合至表面，并被抗BMP two IgG抗体所识别。通过氨基荧光红比色法对表面固定的RH BMP two进行定量，结果显示，在细胞刺激后，该蛋白仍可在表面检测到。对呈现固定化RHB MP two的表面所引发的细胞反应进行了评估，并与未经处理的金基底表面效应进行比较。在此，C2C12细胞由上方接近经RHB MP two功能化的表面，受到刺激30分钟。

在此模型中，BMP2抑制细胞向多核肌管的分化，并诱导成骨细胞表型。通过蛋白质印迹法分析BMP2信号通路下游报告分子SMAD1/5/8的激活情况，结果如图所示。经BMP2刺激30分钟后可观察到SMAD蛋白的磷酸化，而在未处理的金样品处理的细胞中未观察到SMAD1/5/8的磷酸化。

该结果表明，固定化过程并未改变BMP-2的短期活性，并且能够触发Smad信号通路的早期步骤，以确定BMP-2是否影响长期成骨分化。通过比色法检测碱性磷酸酶的表达水平。在普通金表面和BMP-2表面培养细胞六天后，测定C2C12细胞的碱性磷酸酶活性。

在I BM P两种表面上培养的细胞裂解液中，碱性磷酸酶活性相较于对照组显示出显著更高的吸光度。该结果表明，IBMP二可诱导C two C 12细胞中碱性磷酸酶的表达，以研究IBP二对成肌过程的影响。C two C 12细胞直接接种于金表面或功能化表面上，并在低血清条件下进行培养。

六天后，进行肌球蛋白重链染色，结果如图所示。与金基底上的细胞相比，在存在 BMP2 的情况下，C2C12 细胞未能形成肌球蛋白重链阳性的肌管。在此基础上，可通过将 BMP2 固定在金纳米颗粒上等其他方法，进一步回答更多科学问题。

例如，局部需要多少固定化的 BMP2 才能有效触发信号响应。