利用原生质体研究蛋白质向叶绿体的导入

这一方法有助于解答细胞生物学领域中的一些问题，例如蛋白质输入叶绿体的过程。该技术的主要优势在于能够在活体条件下研究蛋白质向叶绿体的输入。本次实验操作将由我实验室的两名博士后 Junho Lee 和 Hyangju Kang 演示。

首先，从一到两个B5培养板中选取两周大的完整植株叶片组织。使用手术刀切割叶片，并将其放入含有25毫升酶解液的50毫升锥形管中。将锥形管水平置于旋转摇床上，在22°C避光条件下轻轻振荡孵育8至12小时，直至溶液中仅剩叶柄和茎组织。

孵育结束后，将含有释放出的原生质体的酶溶液通过孔径为140微米的滤网过滤至新的培养皿中。然后，小心地将该溶液叠加在50毫升锥形管中15毫升21%蔗糖溶液的上层。将锥形管置于水平转子离心机中，以最低加速度和减速度设置，在98 ×g 条件下离心10分钟。

随后，使用帕特拉移液器小心地移除最上层含有酶溶液的原生质体，以及酶溶液与蔗糖溶液界面处的原生质体。将此溶液转移至含有30毫升W5溶液的50毫升锥形管中，并倒置管子以混匀。在51 ×g条件下离心6分钟。

使用移液器小心弃去上清液，注意不要扰动沉淀中的原生质体。加入 25 毫升 W5 溶液，轻轻重悬原生质体。为确保稳定，需在 4 °C 冰箱中孵育至少一小时。

在4摄氏度孵育后，以46 × g离心2分钟，彻底沉淀原生质体。小心完全去除上清液，并加入MANG溶液至原生质体沉淀中，使浓度达到每毫升5 × 10⁶。用移液器将10微克质粒DNA和300微升原生质体溶液加入一支新的13毫升圆底试管中。

用手轻轻旋转离心管混匀，然后立即加入 300 µL 新鲜配制的 40% PEG 溶液。将离心管几乎水平倾斜，用手轻轻旋转数次，充分混匀。室温孵育 30 分钟。

然后加入1毫升W5溶液，用手轻轻旋转试管，充分混匀，方法同前。将样品在室温下孵育10分钟。重复此步骤两次，第一次加入1.5毫升W5溶液，第二次加入2毫升W5溶液；每次加入后均需混匀，最后一次混匀后，孵育30分钟。

将离心管在46 ×g下离心4分钟，然后弃去上清液。向沉淀中加入2毫升W5溶液，以与之前相同的方式轻轻但充分地混匀。在22 °C避光条件下孵育18小时。

为了利用荧光显微镜分析蛋白质导入，使用带有修整尖端的移液器将10微升原生质体溶液滴加到玻璃载玻片上。用盖玻片小心覆盖溶液，避免损伤原生质体。将载玻片置于荧光显微镜载物台上，设置激发滤光片以观察绿色荧光蛋白和叶绿素自发荧光。

使用冷却的电荷耦合器件相机采集图像，并利用图像编辑软件处理，生成伪彩色图像。进行总蛋白提取和免疫印迹时，从原生质体溶液中取出1 mL，将剩余的1 mL混合。将该原生质体溶液转移至离心管中，在46 ×g下离心4分钟。

离心完成后，移除上清液，加入80微升变性缓冲液，涡旋剧烈振荡5秒。加入5倍XDS上样缓冲液，充分混匀后煮沸10分钟以进行变性。

使用抗GFP抗体进行标准的SDS-PAGE和免疫印迹分析。RbcS和TGFT是一种融合构建体，编码含有转运肽的RBCS的C端79个氨基酸残基，并与GFP融合，用于通过荧光显微镜和免疫印迹研究蛋白质向叶绿体的导入。在荧光显微镜下观察时，来自目标蛋白的绿色荧光信号与叶绿素自发红色荧光信号重叠，表明蛋白已导入叶绿体。

在分离总蛋白后，免疫印迹中观察到两条蛋白条带，表明该蛋白已成功导入叶绿体。上方条带对应全长前体蛋白，下方条带对应导入叶绿体后加工处理的成熟形式。该蛋白加工形式的量随时间延长而增加，提示该蛋白可被导入叶绿体。

随着这一进展，该技术为细胞生物学领域的研究人员探索拟南芥中的蛋白质疲劳或膜丝挑选铺平了道路。