一种非细胞接触式双细胞共培养插件系统的开发

本实验的总体目标是利用带有可渗透膜的插入式培养小室，建立两种细胞类型的细胞共培养体系，从而允许分泌的可溶性因子自由扩散。该过程通过一系列精细操作实现，即将含有第一种细胞类型的插入式培养小室放置于含有第二种细胞类型的多孔组织培养板中。我们首先在插入式培养小室中接种第一种细胞，同时在多孔组织培养板中接种第二种细胞。

第二步是将插入物转移至含有第二种细胞类型的培养板孔中。最终，这使得能够同时收获这两种细胞类型以及各自的上清液。因此，可以评估分泌的可溶性因子对目标细胞类型的影响。

在多细胞生物中，分泌的可溶性因子通过旁分泌信号传导，引发不同类型细胞产生反应。因此，插入式共培养系统的优势在于能够提供一种独特的方法，在无细胞间直接接触的情况下，评估由分泌的可溶性因子介导的细胞参数变化。与其他共培养技术相比，插入式共培养系统具有多种优势，例如：一、实现定向信号传导；二、维持细胞极性；三、可对特定细胞群的细胞变化进行特异性检测。

本文将详细介绍一种用于检测脂多糖激活的N9小胶质细胞所分泌细胞因子对神经元PC12细胞毒性的特定实验方案，从而为插入式共培养技术提供具体理解。首先，打开24孔组织培养板及其0.4微米孔径聚四氟乙烯插入式培养小室的包装，然后使用无菌镊子夹住插入小室的最上缘，将其放入组织培养板的空孔中。

接下来，用常规的 N9 培养基填充小室，直至膜表面完全被覆盖。将小室孵育至少一小时，或过夜，以增强细胞的贴壁能力。待小室准备就绪后，使用常规 N9 培养基将 N9 小胶质细胞按 80% 至 90% 的融合度进行传代，获得细胞悬液，用于接种小室。

然后，从插入式培养小室中移除常规培养基，注意不要用微量移液器吸头刺穿膜。接下来，根据插入式培养小室制造商的说明书，或以每平方厘米60,000个细胞的密度，向每个插入式培养小室中加入50微升细胞悬液进行接种。在分配细胞悬液时，应通过偶尔颠倒试管的方式确保细胞悬液保持均匀。

当所有插入物均接种完毕后，轻轻前后摇动培养板，然后再左右摇动，以使细胞均匀分布。避免做环形晃动，以免细胞在插入物中央聚集。随后，将含有插入物的培养板孵育24小时，再进行N9小胶质细胞的激活。

首先称取10毫克脂多糖，并将其储存于1.5毫升离心管中以备后续使用。由于脂多糖是一种强效的促炎性内毒素，需要采取特殊的安全防护措施，强烈建议佩戴护目镜、手套和颗粒物呼吸器。随后，使用温热的N9处理培养基对脂多糖进行一系列梯度稀释，以获得4、2和1微克/毫升的工作溶液。

最后，从插入物中移除一半的培养基，注意不要扰动细胞。然后，轻轻向插入物中加入 25 微升脂多糖工作液，使其终浓度分别为每毫升 2、1 或 0.5 微克。继续孵育 24 小时后，再进行共培养实验。

此步骤需要使用已接种于每平方厘米30,000个细胞的PC12细胞、分化的中间神经元，以及如前文所述用脂多糖活化24小时的N9小胶质细胞。首先，轻柔地移除插入物中的全部培养基，并替换为50微升新鲜且预温的N9处理培养基。此操作旨在彻底去除脂多糖残留，仅保留活化的N9小胶质细胞。

请注意，插入物在组织培养板的孔中是松动的，如果移液枪头过度紧贴孔壁，可能会导致其移动。为避免细胞因长时间暴露于空气中而干燥，此步骤应逐个插入物进行操作。随后，完全移除神经元PC12细胞培养基，并加入0.6毫升新鲜的、预温的PC12处理培养基。

一次只操作一个，以确保细胞不会干燥。使用镊子夹住插入物的最上缘，轻轻将其放入含有神经元型PC12细胞的孔中。当所有插入物转移完毕后，检查插入物膜下方是否存在气泡。

气泡会阻碍插入物膜上的任何物质交换，并可能危及整个实验。使用镊子非常轻柔地将插入物从孔中提起并重新放回细胞培养基中，以此去除气泡，该操作应能消除大部分气泡。然而，对于顽固性气泡，可尝试以一定倾斜角度将插入物轻轻再次浸入细胞培养基中。

请勿敲击或搅动小室，以免导致贴壁细胞脱落。随后检查小室和孔内培养基的体积，两个区域的液面应大致齐平。待所有气泡完全去除且培养基体积合适后，将培养板放入培养箱孵育。

随后可收集细胞、培养基或两者，以检测N9小胶质细胞与神经元样PC12细胞之间旁分泌信号传导的作用。对下层隔室的细胞培养基进行酶联免疫吸附测定，以定量促炎性细胞因子。结果显示，在激活期24小时后，用2微克/毫升脂多糖处理的N9小胶质细胞所分泌的促炎性细胞因子（如白细胞介素-6、肿瘤坏死因子-α和干扰素-γ）显著高于未经处理的小胶质细胞。

此外，用每毫升一微克脂多糖处理的 N9 小胶质细胞在 24 小时后分泌的干扰素 γ 显著增多，而白细胞介素-6 和肿瘤坏死因子-α 在细胞培养基中的水平则需 48 小时才能观察到显著升高。相比之下，在激活后的 24 小时和 48 小时，每毫升 0.5 微克的处理条件均未能增强 N9 小胶质细胞中细胞因子的表达。此外，每毫升两微克组在 24 小时的数据表明，出现了小胶质细胞增生，即小胶质细胞数量增加。

然而，直到48小时后，细胞数量才显著增加。最后，为了评估小胶质细胞活化导致细胞因子分泌增加和小胶质细胞增生的后果，检测了共培养的神经元PC12细胞的细胞毒性。通过测定受损细胞释放的胞外乳酸脱氢酶水平，发现随着N9细胞上脂多糖浓度的增加，神经元PC12细胞的死亡数量也随之增多。

因此，这些结果表明，分泌的可溶性因子能够穿过共培养小室的膜，并在无细胞间直接接触的情况下对神经元PC12细胞造成细胞毒性损伤。尽管此处仅展示了一种共培养小室的实验情景，但该技术具有很高的灵活性。在本方案中，一种细胞类型首先经过某种分子预处理，以减少可溶性因子的分泌；随后将小室转移至培养孔中，从而影响第二类细胞的行为。

然而，可以将两种细胞类型在共培养体系中共同孵育，以检测其中一种或两种细胞群体对后续处理的敏感性增强或耐受性。例如，该技术可简单地利用两种细胞群体在无任何处理的情况下共同孵育，以评估基础状态下的旁分泌相互信号传导。除了如本研究中所展示的在神经炎症领域具有重要价值外，插入式共培养系统还可用于回答涉及肿瘤再生、神经腊样病变、细胞凋亡信号传导，或任何其他含有旁分泌信号成分的广泛科学问题。

观看本视频后，您现在应该对插入式共培养系统如何提供一种简便方法来评估分泌的可溶性因子所介导的变化有了深入理解。我们希望已使您认识到，在无细胞间直接接触的情况下，这种插入式共培养系统在多细胞旁分泌信号研究中具有很高的应用潜力。