使用TAP标签亲和纯化叶绿体转运子蛋白复合物

该方法有助于回答叶绿体研究领域中的关键问题，例如叶绿体蛋白导入机器的组成。这一过程对于植物变绿和光合作用至关重要，因而对全球粮食生产具有重要意义。该分子机器由位于叶绿体外膜和内膜的两个独立复合物组成，分别称为TOC和TIC，但其具体组成尚未完全明确。

该技术的主要优势在于，拟南芥TOC/TIC复合物的纯化可通过一步法纯化技术（TAP-TOC纯化）完成。这是一种特异且高效的纯化方法。通常，刚接触该方法的研究人员可能会遇到困难，因为他们对叶绿体膜组分的分离、去垢剂的使用、溶解过程或亲和纯化步骤不熟悉。

在准备好拟南芥植株后，取三周龄的幼苗10克，在液氮中用预冷的研钵和研杵加沙研磨。向研磨后的组织中加入20毫升预冷的提取缓冲液，充分混匀，并将混合物置于冰上解冻。

接下来，用研磨缓冲液浸湿两层快速过滤材料。将匀浆液通过这两层过滤材料过滤至一个50毫升的锥形离心管中。在4摄氏度条件下，以1,500 × g离心10分钟，然后将上清液转移至一个新的预冷的50毫升锥形离心管中。

在相同条件下再次重复离心一次。将上清液转移至预冷的38.50毫升超速离心管中，并用预冷的研磨缓冲液定容至35毫升。使用超速离心机在100,000 ×g、4 °C条件下离心一小时。

使用玻璃-聚四氟乙烯匀浆器，将绿色沉淀重悬于研磨缓冲液中。在4°C条件下，以100,000 × g离心1小时，弃去上清液。使用玻璃-聚四氟乙烯匀浆器将绿色沉淀重悬于18.75毫升1×研磨缓冲液中。

然后加入 9.375 毫升 1× 研磨缓冲液。再加入 9.375 毫升 4× 溶解液，使最终体积达到 37.5 毫升，并在 4 °C 下于旋转摇床上孵育 30 分钟。此后，使用超速离心机在 100,000 ×g 和 4 °C 条件下离心样品 1 小时。

将含有溶解膜成分的上清液转移至一个新的50毫升圆锥形离心管中。在制备好IgG琼脂糖树脂后，将其先前洗涤过的IgG琼脂糖树脂转移至含有37.5毫升溶解膜成分的50毫升圆锥形离心管中。在4摄氏度下于旋转摇床上孵育过夜。

第二天，在100 × g、4°C条件下离心IGG琼脂糖树脂5分钟。用移液器吸去上清液。用37.5毫升缓冲液A洗涤IGG琼脂糖树脂，并在室温下于旋转摇床上孵育10分钟。

继续按照文本方案中所述进行树脂的沉淀和洗涤。随后，将IgG琼脂糖树脂转移至带有35微米滤膜的500微升离心柱中。用300微升TEV洗脱缓冲液洗涤树脂珠两次，每次300微升，以进行平衡。

接下来，加入含有10微升TEV蛋白酶的300微升TEV洗脱缓冲液。将装有磁珠的离心柱置于Thermomixer中，在16摄氏度、350转/分钟条件下孵育2小时。然后打开离心柱，将其放入一个新的、洁净的1.5毫升离心管中。

在100 × g、4 °C条件下离心5分钟，收集洗脱液。本研究中，从转基因拟南芥（A.thaliana）植株中纯化了带有TAP标签的叶绿体包膜蛋白复合物。免疫印迹分析证实，分离得到的TAP-TOC159与TOC复合物中的TOC75和TOC33存在相互作用。

叶绿体外膜激酶KOC1已知可磷酸化TOC159，也一同被共纯化出来。TIC110的存在表明，所纯化的TAP-TOC159复合物还包含TIC复合物的组分。FBN1A抗体未检测到TAP-TOC159复合物，表明无污染成分存在。

在阴性对照中，免疫沉淀的NTAP蛋白未与任何TOC或TIC蛋白共纯化，证实了TAP-TOC159纯化的特异性。尽管该方法可用于研究叶绿体蛋白的导入过程，但它也可能适用于拟南芥瓶系统中的其他任何复合物。在完成该实验步骤后，可进一步采用其他方法，如蛋白质印迹（western blotting）或质谱分析，以验证已知组分的存在，或鉴定TOC和TIC复合物中的新组分。

该技术为叶绿体蛋白导入领域的研究铺平了道路，使研究人员能够探索TOC和TIC复合物中新组分的功能。