利用寡核苷酸定向洗脱法从细胞中分离同源RNA-蛋白质复合物

该RNA免疫沉淀技术的总体目标是通过特异性的寡核苷酸定向富集，选择性地分离和表征真核细胞内源性形成的RNA-蛋白质复合物。该方法有助于回答转录后调控领域中的关键问题，例如，结合在逆转录病毒转录本5'非翻译区的RNA结合蛋白的组成如何调控其基因表达。该技术的主要优势在于，它使研究人员能够选择性地分离和表征特定的RNA-蛋白质复合物，同时仍保留对下游核糖核蛋白（RNP）进行更全面分析的可能性。

该技术的意义在于深化对病毒感染及多种细胞疾病的基础理解，并为基因表达转录后调控机制提供重要见解，这可能意味着发现新的可行药物靶点。

根据文本方案培养细胞并进行FLAG标签蛋白的免疫沉淀后，将60微升每次免疫沉淀所需的Pro-TG磁珠悬液转移至1.7毫升微量离心管中。将试管置于磁力架上，小心用移液器吸除保存液，随后将试管从磁力架上取下。

加入 600 µL 的 1× 洗涤缓冲液。将离心管置于室温下的翻转混合仪上孵育 3 分钟，以洗涤并平衡磁珠。将离心管放在磁力架上，吸除洗涤缓冲液。

然后加入10倍体积的新鲜1×洗涤缓冲液。将免疫沉淀用FLAG抗体加入已平衡的前体TG磁珠中。室温下旋转孵育试管至少30分钟，使免疫沉淀抗体与磁珠结合。

将试管置于磁架上，移除上清液。随后将试管从磁架上取下，向磁珠中加入1×洗涤缓冲液，室温下旋转孵育3分钟。重复洗涤步骤两次，最后吸除缓冲液。

用移液枪吸去细胞的培养基，加入1.5毫升预冷的PBS洗涤细胞两次。用细胞刮刀刮下湿润且贴壁的细胞。将细胞悬液转移至新的离心管中，然后在4°C条件下以226 × g离心4分钟。

向细胞沉淀中加入 375 微升冰上预冷的低盐缓冲液，在冰上孵育样品 5 分钟，以使细胞充分膨胀。在加入低盐裂解缓冲液并重悬细胞沉淀时，需格外小心，确保细胞完全浸没并充分膨胀，同时避免过早发生机械性破坏。为收集细胞质裂解液，加入 125 微升冰上预冷的裂解缓冲液，然后使用预冷的 Dounce 匀浆器进行 10 次抽打。

使用足够力度进行Dounce匀浆，以实现细胞膜裂解并释放细胞质裂解物中的污染物。但需注意避免过度机械破碎，以防造成核污染、RNA-蛋白质复合物破坏或释放物的损失。将匀浆液在微量离心机中以最高速度离心一分钟，随后将上清液转移至预先置于冰上的新的1.7毫升离心管中。

测定总蛋白浓度。保留10%用于蛋白质印迹分析，作为输入对照。进行免疫沉淀时，将收集的细胞裂解液按所需体积加入与目标抗体偶联的磁珠中。

使用1×洗涤缓冲液将总体积调至600微升，并在室温下旋转孵育样品。孵育90分钟后，将免疫沉淀管置于磁力架上以收集磁珠。随后收集上清液，并将其作为流穿液保留备用。

接下来，向结合了RNP的抗体偶联磁珠中加入10倍体积的冰冻NETN 150洗涤缓冲液，在室温下旋转孵育3分钟。按照文本方案，将固定的RNP复合物重悬于1×结合缓冲液后，用100微升冰冻的1×结合缓冲液补足剩余体积，并将离心管置于70摄氏度加热3分钟。

为了分离特异性RNA-蛋白质复合物，加入一段约30个核苷酸的DNA寡核苷酸，该寡核苷酸与目标RNA的3'端序列边界互补。在室温下轻轻振荡孵育30分钟。向管中加入5至10单位的RNase H，在室温下孵育样品1小时，以切割RNA-DNA杂交链中的RNA。

然后将含有目标捕获RNP复合物的上清液转移至无菌的1.7毫升微量离心管中。为收集免疫沉淀的RNA，将捕获RNA复合物总样本的一半重新悬浮于750微升酸性硫氰酸胍试剂中。向管中加入200微升氯仿，剧烈振荡10秒，并在室温下孵育3分钟。

离心后，将水相收集到新离心管中，并加入等体积的异丙醇。充分混匀后，于室温孵育样品至少十分钟。向样品中加入一微升甘醇蓝，并于负20摄氏度保存，以实现有效沉淀或留待日后处理。

在4°C条件下，以16,000 × g离心10分钟。使用P200移液器小心收集并弃去上清液，避免扰动RNA沉淀。向每个离心管中加入500 µL 75%乙醇。

涡旋并离心试管5分钟。小心收集并弃去上清液，操作方法如前所示。将沉淀在空气中干燥2至3分钟，加入100 µL无RNase的水重新悬浮沉淀。

将100微升RNA样品加入RNA纯化柱中，按照生产商提供的操作步骤进行处理。最后，用30微升无RNase的水洗脱RNA，并于-80°C保存，可保存长达三个月。

为了分离转录后调控元件（PCE）、GAG、RNA以及在增殖细胞中形成的RHA核糖核蛋白复合物，对转染的HEK293细胞裂解液进行了FLAG-MS2 RNP免疫沉淀实验。结果显示FLAG-MS2蛋白被有效沉淀。

由于DHX9/RHA存在于RNP复合物中，而不存在于IgG同型对照或阴性对照中。此处显示的是经RNase H消化的RNA-DNA复合物的蛋白质印迹结果。RNase H切割PCE GAG RNA，特异性释放出与5'非翻译区结合的RNP复合物。

在洗脱液中富集了与 DHX9/RHA 相关的核糖核蛋白复合物（RNP）。重要的是，FLAG-MS2 结合的核糖核蛋白复合物仍保留在与抗体偶联的磁珠中。本实验通过 RT-PCR 和 QRT-PCR 验证了在细胞和洗脱液中含逆转录病毒 PCE GAG RNA 的 MS2 发夹结构的 HO 免疫沉淀。

实验结果证实了 DHX9/RHA 与逆转录病毒 5' 非翻译区（UTR）之间存在特异性结合，该区域被强调为一种独特的核糖核蛋白复合物（RNP），在靶向翻译调控中具有重要作用。一旦掌握，若操作得当，该技术可在约五小时内完成。在进行该实验时，需注意每一步操作均应高效且谨慎，以确保完整的 RNP 复合物得以维持，并成功分离出目标特异性 RNP 复合物。

采用此方法后，还可进一步开展质谱分析和RNA-Seq等其他实验，以回答更多科学问题，例如目标RNA与全基因组范围内蛋白质的相互作用，以及特定核糖核蛋白（RNP）复合物中所有结合转录本的区域或全序列分析。该技术自建立以来，为转录后基因调控领域的研究人员提供了有力工具，使其能够深入探究调控病毒致病基因表达以及细胞基因表达调控普遍机制的特异性RNA-蛋白质复合物。

观看本视频后，您应能充分了解如何收获完整的细胞内核糖核蛋白（RNP）复合物，并利用特异性寡核苷酸引导富集技术来确定其组成。还需注意，操作病原性病毒、生物样本以及酸或苯酚等危险化学品时可能具有极高危险性。进行本实验操作时，务必采取一切必要预防措施，例如穿戴适当的个人防护装备。