以微流控芯片确定性建立基于单细胞的共培养体系

为了理解细胞间相互作用对细胞行为的影响，必须将捕获效率与活细胞动态成像观察有效结合。该微管可在较大的腔室内高效捕获多个单细胞，并提供充足的培养基础，用于动态追踪多个单细胞间的相互作用行为。首先准备PDMS装置。

将带有100微升三氯硅烷的晶圆模具放入称量皿中，置于干燥器内抽真空15分钟。停止抽真空后，在37摄氏度下于干燥器中对晶圆模具进行硅烷化处理，时间不少于1小时。按10:1的比例混合PDMS基础剂与PDMS固化剂，然后将总共20克的混合物倒入直径15厘米培养皿中的晶圆模具上。

将直径15厘米的培养皿放入干燥器中，抽真空1.5分钟。随后将培养皿从干燥器中取出，并用氮气去除PDMS中的残留气泡。将培养皿置于65 °C的烘箱中加热2至4小时，使PDMS固化。

完成后，将PDMS复制品从晶圆模具上取下，并在PDMS上打一个1.5毫米的入口和一个0.5毫米的出口。用可剥离胶带清洁PDMS复制品和载玻片表面，然后用氧气等离子体处理表面。

然后，手动将PDMS复制品与载玻片对齐，并使其相互接触。将PDMS载玻片置于65摄氏度的烘箱中放置一天。第二天，将PDMS装置浸入盛有PBS的容器中。

将其放入干燥器中，并抽真空15分钟。将装置转移至细胞培养超净台，用紫外光照射30分钟进行灭菌。用培养基替换PDMS装置中的缓冲液，并在4摄氏度下孵育一天。

当细胞达到70%至80%融合度时，移除培养基，并用5毫升PBS轻轻洗涤三次。向WNT5B sh4和pLKO-GFP细胞中加入含有1 µM荧光染料的1毫升DMEM/F-12培养基，在室温下孵育30分钟。孵育结束后，用5毫升无菌PBS轻轻洗涤细胞三次，移除PBS，然后加入2毫升0.25%胰蛋白酶-EDTA。

将细胞在室温下孵育 4 分钟，然后轻轻敲击培养皿以促进细胞脱落。加入 4 毫升 DMEM/F-12 培养基以分散 WNT5B sh4 和 pLKO-GFP 细胞，将细胞转移至 15 毫升离心管中，并在 300 ×g 下离心 3 分钟。弃去上清液，并将细胞沉淀物轻轻重悬于 1 毫升 DMEM/F-12 培养基中。

制备1毫升细胞悬液，浓度为每毫升3 × 10⁵个细胞，并置于冰上以防止细胞聚集。将聚四氟乙烯管连接至装置出口与注射泵之间。吸除培养基，然后向PDMS装置的入口加入1 µL已制备的细胞悬液。

接下来，使用注射泵以每分钟 0.3 微升的流速将细胞悬液加载到装置中。向装置的入口加入 1 微升 DMEM/F-12 培养基，然后使用注射泵将培养基加载到装置中。以每分钟 10 微升的流速，使用注射泵将 0.3 微升 DMEM/F12 培养基加载到装置中。

细胞加载完成后，取下管子，并用聚烯烃胶带密封入口和出口，以构建封闭的培养系统。将PDMS装置转移至直径10厘米的培养皿中，并在装置周围加入10毫升无菌PBS，以防止培养基蒸发。将培养皿放入培养箱中进行三重单细胞培养。

PDMS 装置具有三层结构，包含一个连接培养室和旁路通道的捕获位点。由于培养室与旁路通道之间的流动阻力不同，细胞可流入捕获位置，随后进入的细胞则通过旁路通道到达下一个捕获位点。回流步骤用于将细胞从捕获位点释放并送入培养室。

本方案的细胞捕获效率在三种不同细胞类型上进行了评估：人淋巴内皮细胞（LECs）、表达针对WNT5B的特异性短发夹RNA的人口腔鳞状细胞癌T2.6细胞，以及pLKO-GFP载体对照细胞。这三种细胞的单细胞捕获效率分别为：LECs约71%，WNT5B sh4细胞约74%，pLKO-GFP细胞约78%。

三重单细胞捕获效率为48%。该方法可用于淋巴管内皮细胞与鳞状癌细胞的多种单细胞共培养，可在显微镜下观察细胞的增殖情况和形态。需确保制备的细胞悬液中细胞聚集体尽可能少，因为细胞聚集体不仅会降低单细胞配对效率，还可能堵塞微通道。单个细胞之间的细胞间相互作用在调控细胞行为中起着重要作用。

我们的方法可为研究人员提供一种高效工具，用于在单细胞水平上研究细胞间的相互作用，这可能有助于发现那些通过基于群体的研究难以获得的新机制。