利用微阵列技术探究肿瘤微环境对细胞表型的影响

由于肿瘤微环境具有复杂性，对其进行研究十分困难。我们开发了微环境微阵列（MEMA），该阵列由简单的组合式微环境构成，可用来识别驱动肿瘤细胞表型的主要因素。MEMA 平台的主要优势在于，由于所有微环境条件均被明确定义，因此能够直接鉴定出驱动特定表型的微环境因子。

MEMA 平台在其他非癌症系统中具有广泛的应用性，包括原代细胞株和干细胞。我们开发了多种工程技巧和步骤，以加快湿实验操作并简化实验方案。首先，使用接触式点样打印机将细胞外基质打印混合物点样到八孔板的定位标记位点上。

使用直径为350微米的针头，以四乘七的打印头配置，在微环境微阵列（MEMAs）上打印细胞外基质。胶原蛋白块以网格形式打印到MEMAs上。含有PBS的孔提供额外湿度，防止细胞外基质打印混合物源板干燥。

在八孔板中以20列×35行的形式打印阵列，共700个点。打印后，将板置于干燥器中至少存放三天，方可使用。首先，设计一个96孔板的布局，其间距应允许使用带有四个间隔吸头的多通道移液器，以便可同时处理多个MEMA板。

然后从冷冻机中取出配体，在超净工作台中的冰上解冻。轻轻弹击并短暂离心每个离心管。使用生产商推荐的缓冲液将配体稀释至200倍工作浓度。

用移液器将每种200倍配体储备液各10微升加入96孔板中对应的孔内。使用封板膜密封96孔板，并于-20摄氏度保存。配体处理板应分批制备，并记录所有元数据以供下游分析使用。

在培养细胞之前，每孔加入两毫升防非特异性吸附的封闭缓冲液，封闭20分钟。使用带有两根巴斯德吸管的Y型分流器，可同时吸除多个孔中的封闭缓冲液，随后用PBS洗涤三次。为防止孔内干燥，在准备接种细胞前，保留最后一次PBS洗涤液于孔内。

在进行完整的 MEMA 实验之前，通过细胞滴定实验优化 MCF7 细胞的接种浓度。理想的点样区域应具有足够的细胞数量以提取数据，但又不能过多，以免区域过度融合。在 MEMA 中，吸除残留的 PBS，并在 2 毫升接种培养基中每孔接种 30,000 至 35,000 个 MCF7 细胞。

将 MEMA 置于 37 摄氏度的培养箱中。在培养箱中孵育过夜后，吸除培养基，并更换为两毫升的低浓度生长培养基，以分离特定配体的刺激作用。随后将预先冷冻的配体处理板置于冰上解冻。

将解冻的培养板在200 × g离心1分钟。从MEMA培养板的每个孔中转移200 µL培养基至配体处理板中相应的孔。用移液器吹打混匀配体与培养基，然后将此混合液转移回MEMA培养板中相应的孔。

用手轻轻摇动，然后将 MEMA 板放回培养箱中，在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳条件下培养配体-ECM 组合。71 小时后，向 MEMA 孔中加入 100 倍体积的 EdU，使其终浓度为 10 微摩尔。在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳条件下继续孵育 1 小时。

最后一次孵育后，吸出各孔中的液体。每孔加入2毫升2%多聚甲醛（PFA），室温下固定15分钟。然后吸出孔中的PFA溶液。

每孔加入2毫升0.1%非离子型表面活性剂，室温孵育15分钟进行透化处理。吸除表面活性剂，随后每孔依次加入2毫升PBS和PBS-T洗涤。然后，每孔加入1.5毫升EdU检测反应试剂。

室温下孵育一小时，期间轻轻振荡并避光。然后每孔加入1.5毫升商用淬灭缓冲液终止反应。再次吸去液体，用PBS-T洗涤，随后加入优化浓度的染料或抗体进行孵育。

将MEMA孔板与一抗在染色缓冲液中孵育，于4摄氏度轻轻摇动过夜。一抗孵育结束后，用PBS洗涤孔板，随后用PBS-T洗涤。将二抗用染色缓冲液稀释后加入，终浓度为0.5微克/毫升DAPI。

室温避光振荡孵育一小时。用 PBS 洗涤两次，每次每孔 2 毫升，并在最后一次加入 2 毫升 PBS 后保留。为成像染色后的 MEMA，将其置于配备适当荧光检测通道的自动成像系统的显微镜载物台上。

将生成的图像数据输出至图像管理系统。使用 CellProfiler 对细胞进行分割并计算荧光强度水平。在本方案中，一个八孔板中按区间分组的 DAPI 强度值与细胞计数所绘制的细胞周期分布图，可指示处于 G1 期与 G2 期的细胞。

这对应于处于早期生长期细胞中的两份核DNA含量，以及即将进行有丝分裂的细胞中的四份核DNA含量。图中展示了配体和细胞外基质（ECM）微环境对细胞数量和EdU掺入的影响。红色表示较高的细胞数量，蓝色表示较低的细胞数量。

许多效应是由配体驱动的，因为细胞外基质（ECM）条件对细胞数量或EdU阳性率影响不大。Natagen 1 是一个明显例外，该ECM分子的存在会抑制MCF7细胞的黏附和生长。诸如FGF6和神经调节蛋白-1α之类的配体可增加细胞数量，并具有较高的EdU掺入率，而诸如双调蛋白和神经调节蛋白-1 SMDF之类的配体则会抑制细胞的黏附和生长。

在经神经调节蛋白-1α处理的MEMA位点上生长的MCF7细胞示例显示EdU掺入率较高，表现为粉红色细胞核。该图像中，绿色染色为细胞膜标记，蓝色为DAPI染色。由于完整的MEMA实验成本较高，因此在开展完整实验前进行优化步骤（如细胞和血清滴定）至关重要。

一旦利用MEMA平台确定了感兴趣的微环境条件，便可借助传统的二维和三维细胞培养系统对特定的配体和细胞外基质蛋白进行更深入的研究。