融合绝对定量与相对定量PCR数据以定量STAT3剪接变异体转录本

本实验方案的总体目标是定量分析嗜酸性粒细胞中STAT3剪接变异体转录本的比例及其绝对表达水平。该方法可用于解答剪接调控领域中的关键问题，例如远端剪接事件的共发生关系，以及识别可导致串联剪接比例发生变化的条件。该技术的主要优势在于利用质粒标准品，能够获得绝对和相对的qPCR数据，从而确定四种STAT3转录本的比例及总体表达水平。

在本研究中，我们希望了解当嗜酸性粒细胞受到细胞因子刺激时，四种 STAT3 亚型 S alpha、S beta、delta S alpha 和 delta S beta 的变化情况。尽管该方法可揭示嗜酸性粒细胞中 STAT3 的组成，但也可应用于其他能够获得 cDNA 的细胞类型。由于 S 和 delta S 仅在三个核苷酸上存在差异，因此为了实现每种亚型标准品的特异性，我们必须牺牲一定的效率。

本方案中，以从人嗜酸性粒细胞制备的 cDNA 作为模板，用于扩增 STAT3 剪接变体。在按照文字方案构建质粒后，准备多个菌落的质粒进行测序反应。每个 20 微升的测序反应体系应包含 3 微升测序反应缓冲液、2 微升测序反应混合液、12 微升超纯水、1 微升质粒和 2 微升测序引物。

当测序结果可用时，分析编码各变异体的质粒的电泳图谱，包括 S alpha、S beta、delta S alpha 和 delta S beta。测定纯质粒 DNA 的浓度，单位为纳克每微升，并计算每微升的拷贝数。开始此操作前，使用超纯水制备 STAT3 质粒的一系列 10 倍稀释液。

每微升含有约10的8次方至10的3次方个拷贝。测定浓度最高样本的浓度。使用稀释后的质粒为每种剪接变体分别制备四种非靶标混合液作为阴性对照，每种变体的浓度为每微升10的6次方个拷贝。

将四种模板配制成等浓度的靶标混合液，每种模板浓度为每微升10的6次方拷贝。为每种剪接变体配制引物对溶液，加入60微升引物，每种引物浓度为7微摩尔，使样本中终浓度达到560纳摩尔。用纯水将DNA聚合酶和双链DNA结合染料混合液按7比5的比例稀释。

按照此模板在96孔PCR板中建立反应体系。首先向每个孔中加入21微升稀释的DNA聚合酶和双链DNA结合染料混合液，然后加入2微升引物混合液和2微升模板。

在每个无模板对照孔中加入两微升过滤水，代替模板。每个反应设置两个重复孔，以评估重复性。用粘性封板膜密封qPCR板，并在12摄氏度、1,200 ×g 条件下离心五分钟。

打开qPCR仪并插入密封的qPCR板。如果使用ABI实时PCR系统，请按照演示设置实验：点击“File”（文件），选择“New”（新建），点击“Next”（下一步），选择“New Detector”（新建检测器），然后输入名称，并选择报告荧光基团（Reporter）和淬灭基团（Quencher）。

为每种剪接变体设置一个新的检测器。选择“下一步”，然后根据“设置样本板”页面的提示设置标准品，确保将数量输入表格中，并选择相应的检测器。单击“完成”。

设置适当的PCR循环程序。确保在每个循环的72摄氏度步骤期间进行荧光读取，以确定阈值循环值。选择运行。

当运行完成后，单击“结果”选项卡中的“扩增曲线”选项卡。评估输出的扩增曲线以判断数据质量。呈指数增长的曲线表明扩增结果可靠。

将结果导出至电子表格软件。按照文本方案中所述进行数据分析，是判断该检测是否需要进一步优化以提高可重复性的关键步骤。本检测所用的 cDNA 是由经细胞因子处理以促进转录的嗜酸性粒细胞制备而来。

将两份样品cDNA等分试样进行系列稀释，稀释范围为1至1,024倍。在96孔板中建立25 µL反应体系，用于分析引物特异性，同时设置多种引物浓度，针对泛STAT3和内参基因GUSB进行检测。本表展示了实验设计模板。

将密封的PCR板放入qPCR仪中。使用软件设置实验，为GUSB添加新的检测通道，并选择合适的PCR扩增程序。随后，根据文本方案中的描述，利用结果计算每个样本的阈值循环数（Ct值）。

开始此实验步骤时，首先比较在相对定量qPCR中获得的内参基因GUSB的循环阈值（Ct值），并根据结果用超纯水相应稀释cDNA，以确保所有样品的浓度均在同一个数量级范围内。在96孔板中设置样品的绝对定量qPCR反应。S alpha和S beta请遵循此模板，delta S alpha和delta S beta请遵循另一对应模板。

按照先前所示方法进行检测，并至少重复一次检测。接下来，使用泛 STAT3 引物（终浓度 400 微摩尔）和四种质粒的混合物或单一质粒，按照此模板设置绝对定量 qPCR 96 孔板，每孔反应体系为 25 微升。用粘性封板膜密封 qPCR 板，在 12 摄氏度、1,200 ×g 条件下离心 5 分钟。

将密封的 PCR 板插入 qPCR 仪器中，并按照之前所示设置实验，为泛 STAT3 添加新的检测通道。采用与相对定量 qPCR 相同的循环参数。重复实验至少一次后，按照文本方案中所述分析结果。

高质量的qPCR数据会产生S形扩增曲线，表明在扩增循环过程中转录本呈指数增长。这些数据来自含有STAT3 S alpha的质粒的两个系列稀释样本的qPCR检测。每对彩色线条代表在40个循环过程中，重复稀释样本的荧光水平变化。

为模板校准质粒生成的标准曲线将指示扩增效率。本实验中STAT3 S alpha的扩增效率为83.9%。为了评估STAT3水平的一致性，分别测量了四种剪接变体各自的绝对值以及总STAT3的水平。理想情况下，线性回归的相关系数和斜率均应接近于1。

绝对定量qPCR数据以饼图形式呈现，以显示在细胞因子处理过程中四种STAT3剪接变异体所占的比例。整合绝对与相对qPCR数据表明，在IL3和TNFα细胞因子刺激后，所有STAT3剪接变异体的表达水平均上升，并在6小时达到峰值。合并所有时间点的数据发现，β与δS剪接事件之间存在微弱但显著的共关联倾向。

一旦优化完成，如果操作得当，基于该技术的检测可在四小时内完成。在进行此操作时，重要的是要始终在无菌条件下工作，以防止污染。包含或排除一个密码子的剪接决定占框内剪接变异的20%。

我们的方案应可轻松适用于此类变异体的定量分析。该技术建立后，毛张得以加入我与吕丽珊的研究团队，共同在ABC型淋巴瘤细胞中开展STAT3变异体的敲低与重新表达实验。这些实验表明，S型与delta S型变异体的混合存在是细胞在培养条件下存活所必需的。

观看本视频后，您应能够充分理解如何进行绝对定量和相对定量 qPCR，以及如何选择合适的条件来区分和量化细微的剪接差异。