利用流式细胞术定量小胶质细胞对突触物质的吞噬作用

我们的研究重点是心理神经免疫学，致力于探究免疫系统与大脑及心理活动之间的相互作用。我尤其感兴趣的是根据患者的免疫状态解析出不同的亚组，从而为他们找到个体化的治疗方案。本领域最近的进展包括例如PET配体的开发，也包括RNA测序、单细胞RNA测序以及空间RNA测序等先进技术，以解析基于免疫的治疗方法。

本方案旨在解决小胶质细胞吞噬突触物质的定量难题，这对于理解小胶质细胞在脑功能及疾病病理过程中的作用至关重要。本方案可快速、可靠地定量小胶质细胞所吞噬的突触物质，从而揭示其功能活性。本方案将激励其他研究团队在其研究中纳入更多功能性检测方法，例如突触体吞噬实验，进而推动对小胶质细胞在神经免疫相互作用中作用的更深入、更全面的理解。

首先，将一个70微米的滤网置于5毫升聚丙烯管上。用移液器吸取500微升神经细胞培养基，加入滤网上方。将解离的小鼠海马组织匀浆液通过滤网转移至该管中。

然后用移液器将一毫升冷的神经细胞培养基加入匀浆器中，重复两次以冲洗匀浆器。现在，向沉淀中加入500微升冰冻的DPBS以重悬细胞。用DPBS将悬液体积补至1.5毫升。

用移液器向样品中加入500微升等渗Percoll溶液。在离心管中用2毫升冷DPBS覆盖溶液。然后吸除上层液体以及中间相的髓鞘层。

接下来，向管中加入 4 毫升冷的 DPBS。离心后吸除上清液，然后将细胞重悬于 100 微升可固定的活率染色溶液中。在样品离心前，用移液器加入 1 毫升冷的 DPBS，于 300 ×g 离心 5 分钟。

吸去上清液后，加入100微升CD16/CD32染色溶液。涡旋混匀样品5秒，然后进行孵育。孵育结束后，在离心管中向样品加入1毫升FACS缓冲液。

向试管中加入100微升染色主混合液。然后将样品在4摄氏度避光孵育30分钟。现在在离心前向样品中加入1毫升FACS缓冲液，离心步骤同前。

弃去上清液后，将沉淀重悬于250微升固定缓冲液中。接着，向管中加入2毫升通透缓冲液，再次离心。用移液器将100微升VGLUT1染色液加入沉淀中。

然后在孵育和离心前将混合物涡旋约五秒钟。用250 µL FACS缓冲液重悬细胞沉淀。最后，通过40 µm滤膜过滤样品。

与同型对照相比，海马区小胶质细胞显示出更强的VGLUT1-PE荧光信号。与海马区相比，嗅球小胶质细胞中的VGLUT1-PE荧光信号更强，而小脑中的信号较弱。脾脏巨噬细胞中检测到的信号强度最低。

首先，将含有解离的小鼠海马组织的试管置于37摄氏度水浴中孵育20分钟。将浑浊的细胞悬液转移至一个新的15毫升离心管中。弃去上清液后，用5毫升洗涤混合液重悬细胞沉淀。

接下来，将样品通过70微米滤膜过滤至5毫升微量离心管中，随后再次离心。对样品进行Percoll梯度离心。然后将细胞沉淀重悬于100微升max染色缓冲液中，并进行孵育。

现在，在离心前向样品中加入一毫升 max 缓冲液。然后将细胞沉淀重悬于 500 微升 max 缓冲液中。接着，用三毫升 max 缓冲液冲洗磁力分离装置的正向筛选柱。

将500微升细胞悬液轻柔地加入柱中。用max缓冲液洗涤柱三次后，将柱置于15毫升锥形管上。向柱中加入5毫升max缓冲液。

接下来，将样品在300 G条件下离心10分钟。然后向沉淀中加入1毫升预热的DMEM培养基。将500微升最终细胞悬液转移至24孔板的孔中。

向每个孔中加入 250 微升新鲜预热的 DMEM，替换原有培养基。然后在培养基上方加入 3 微克 pHrodo Red 标记的突触体。向阴性对照组加入等体积的未标记突触体。

孵育后，用冷的DPBS洗涤各孔。现在向每孔中加入200微升胰蛋白酶-EDTA溶液。孵育35秒后，向每孔中加入1毫升含FBS的DPBS。

将细胞悬液通过滤网转移至一个5毫升的聚丙烯管中。随后用500微升预冷的DPBS洗涤每个孔两次。以500 × g离心收集的样品5分钟。

随后，将细胞在冰上用 100 微升染色液孵育 10 分钟。接着，向染色液中加入 CD11b 和 CD45，使其终浓度达到 1:100。将样品置于 4°C 避光孵育 20 分钟。

向样品中加入一毫升 FACS 缓冲液。然后在流式细胞术分析前，以 300 ×g 离心 10 分钟。在 CD11b 阳性和 CD45 阳性的小胶质细胞中，观察到与 pH 4 条件下获得的突触体相当的阳性 PE 荧光信号。