流式细胞术与单细胞分析用于表征小鼠出生后早期脑发育过程中小胶质细胞的活化

我们的研究探讨了小胶质细胞如何影响产前脑损伤后的大脑修复。我们的目标是确定调节小胶质细胞活性是否可以改善长期神经系统结果。我相信这是小胶质细胞反应的复杂性，以及以最准确的方式描述这些反应以代表生理反应以及病理反应和疾病的挑战。

我们正在使用不同的模式，例如单细胞 RNA 测序和流式细胞术实验，来表征产前损伤后发育中大脑中的小胶质细胞状态和功能。一个主要挑战是在分离过程中保持细胞活力和小胶质细胞身份，特别是在小脑细胞数量有限的新生儿时间点。它提出了关于生命早期小脑损伤如何导致小胶质细胞亚群的转录改变以及靶向治疗如何调节这些变化的问题。

首先，根据需要解剖小鼠的特定大脑区域。使用镊子，将组织转移到装有小胶质细胞培养基的小培养皿中，置于冰上以维持细胞活力。使用移液器，从培养皿中取出小胶质细胞培养基。

然后，用手术刀在同一个培养皿中将脑组织切细。将均质的脑组织转移到五毫升管中进行酶消化。向每个试管中加入两毫升补充有胶原酶D和DNase 1的汉克斯平衡盐溶液，并用封口膜紧紧密封盖子。

然后，将试管在 37 摄氏度的水浴中孵育 15 分钟，每五分钟摇晃一次。要停止消化，请将试管放在冰上。然后，将匀浆通过 140 微米金属网过滤器以去除大碎屑。

使用玻璃杵轻轻解离过滤器上剩余的细胞。每次洗涤用三毫升小胶质细胞培养基多次清洗金属网过滤器。现在，使用 10 毫升移液器收集滤液并将其转移到 15 毫升管中。

然后，将试管以 500g 在 4 摄氏度下离心 7 分钟。然后，小心地倒置管以丢弃上清液。使用架子，轻轻刮擦管以重悬沉淀。

然后，向重悬的细胞中加入 10 毫升 37% 二氧化硅基胶体培养基溶液。以最小的断裂力将溶液以 500g 离心 10 分钟，在 4 摄氏度下。使用 10 毫升移液器，从溶液顶部吸出髓鞘层。

要洗涤细胞，请加入 10 毫升 Hanks 平衡盐溶液，并在 4 摄氏度下以 500g 离心管 7 分钟。弃去上清液并重悬沉淀后，向管中加入10毫升荧光激活细胞分选缓冲液。离心后，将最终沉淀重悬于剩余的缓冲液中，用于下游应用。

将所有分离的细胞转移到具有锥形底部的 96 孔板中。将板以 500g 在 4 摄氏度下离心 5 分钟。快速倒置板以丢弃上清液。

然后，将细胞沉淀重悬于 25 微升封闭溶液中，并将板在室温下孵育 15 分钟。要制备细胞外抗体染色混合物，请将抗体储备管以 10， 000g 离心以去除聚集体。在不干扰沉淀的情况下，从上清液中吸出所需体积。

使用荧光激活的细胞分选缓冲液，将总体积调整为 25 微升。现在，向每个孔中加入 25 微升细胞外抗体染色混合物，并在室温下孵育板 20 分钟。在不混合的情况下，向每个孔中加入 150 微升荧光激活细胞分选缓冲液。

将板以 500g 在 4 摄氏度下离心 5 分钟。然后，快速倒置板以一次动作去除上清液。将细胞沉淀重悬于 200 微升荧光激活细胞分选缓冲液中，并如前所述离心。

将细胞重悬于100微升皂苷-多聚甲醛缓冲液中，以固定和透化细胞。然后，将板在室温下孵育 10 分钟，避光。在不混合的情况下，向每个孔中加入 100 微升皂苷缓冲液。

将板以 500g 在 4 摄氏度下离心 6 分钟。然后，倒置板以单次运动除去上清液，并将细胞沉淀重悬于 200 微升皂苷缓冲液中。接下来，通过向 11 个空孔中添加 20 微升珠子来制备补偿对照。

为了制备细胞内抗体染色混合物，将抗体储备管以10， 000g离心以去除潜在的聚集体。在不干扰沉淀的情况下，从上清液中吸出所需体积。使用皂苷缓冲液将体积调节至 50 微升。

然后，将细胞沉淀重悬于 50 微升细胞内抗体混合物中。将每种抗体一微升加入相应的珠孔中，并在室温下孵育板 30 分钟。在不混合的情况下，向每个含有细胞样品的孔中加入 150 微升皂苷缓冲液。

向每个补偿对照孔中加入 100 微升荧光激活细胞分选缓冲液以洗涤磁珠。板离心后，将细胞沉淀和对照分别重悬于 200 微升皂苷缓冲液和荧光激活细胞分选缓冲液中。将板以500g在4摄氏度下离心6分钟，除去上清液。

将细胞样品和补偿对照重悬于 200 微升荧光激活细胞分选缓冲液中。将悬浮液转移到标记的荧光激活细胞分选管中。单细胞 RNA 测序根据转录谱鉴定出与其他脑细胞类型分开的不同小胶质细胞簇。

差异表达分析显示，小胶质细胞中基因显著上调，包括Csf1r、Fcrls、Fyb、Adap2和P2ry12。小胶质细胞根据其对CD45和CD11b标记物的不同表达，成功地从活脑样本中分离出来。根据激活标志物的组合鉴定出不同的小胶质细胞亚群，包括 CD80、CD86、iNOS、CD206 和 Arg1、CD86 和 CD64，以及 CD163 和 CD206。

Ptprc 和 Itgam 的标记基因表达在 umap 投影中特异性定位于小胶质细胞簇，证实了这些细胞的身份。小提琴图分析显示，与载体对照相比，处理过的小胶质细胞中抗炎标志物（如 Fcgr1 和 Cd86）的表达较低。