利用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对人源MxA多亚基蛋白复合物的表征

本实验的总体目标是利用非变性十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（non-denaturing sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis）测定细胞裂解液中同源寡聚蛋白复合物的亚基数目。该方法有助于回答细胞生物学领域中的关键问题，例如参与基本细胞过程的蛋白质的寡聚状态。该技术的主要优势在于无需纯化同源寡聚蛋白复合物，也不需要特殊且昂贵的仪器设备。

因此，该实验可在大多数实验室中进行。本实验使用两种类型的细胞：表达内源性黏病毒抗性A蛋白（Myxovirus resistance A protein，简称MxA）的A549细胞，以及过表达MxA的病毒细胞（virocells）。

将A549细胞和病毒感染细胞接种至六孔板中，每孔加入2毫升培养基。在细胞培养箱中孵育过夜。次日，收集细胞。

用一毫升 PBS 清洗每个孔，并加入 0.5 毫升 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 溶液，在室温下作用约五分钟以消化细胞。一旦细胞从培养皿上脱落，立即加入 0.5 毫升完全培养基，通过上下吹打轻轻混匀。将每孔中的细胞转移至 2 毫升离心管中，使用台式离心机离心收集细胞沉淀。

用移液器小心吸去上清液，避免扰动细胞沉淀。加入一毫升冰浴的磷酸盐缓冲液（PBS），轻轻吹打细胞悬液使其混匀。在台式离心机中离心收集细胞沉淀。

用移液器小心吸去上清液，避免扰动细胞沉淀。加入200 µL预冷的裂解缓冲液，通过反复吹打重悬细胞，然后置于冰上。由于裂解缓冲液中的碘乙酰胺对光敏感，应立即用锡箔纸包裹管子以避光保护裂解物。

冰上孵育30分钟。使用碘乙酰胺至关重要，因为碘乙酰胺可通过形成硫醚键不可逆地保护游离半胱氨酸的巯基，防止蛋白质发生非特异性聚集。接下来，在预冷的台式离心机中通过离心去除细胞碎片。

离心过程中，准备截留分子量为10,000的透析柱。将透析柱连接到浮子上，并放入盛有预冷透析缓冲液的烧杯中以平衡透析柱。切勿触碰膜。

将磁力搅拌器放入烧杯中，并将烧杯转移至冷室。使用磁力搅拌器确保轻柔搅拌，在 4 摄氏度下平衡 20 分钟。20 分钟后，从透析缓冲液和浮筒中取出层析柱。

用移液器将澄清的裂解液转移至已准备好的透析柱中，注意不要接触膜。将透析柱固定在浮力浮子上，放回盛有透析缓冲液的烧杯中，然后将烧杯转移至冷室。

将裂解液在4°C条件下透析至少四小时，同时使用磁力搅拌器轻轻搅拌，以去除可能干扰非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的小分子代谢物和盐类。透析完成后，将每份透析样品转移至1.5毫升离心管中。通过台式离心机离心去除沉淀物。

透析裂解液后必须立即进行电泳，以防止寡聚蛋白复合物解离。将内槽和外槽加入预冷的电泳缓冲液。在4°C条件下，使用预冷的电泳缓冲液以每块凝胶25毫安的电流对非变性聚丙烯酰胺凝胶预电泳15分钟。

取15微升制备好的裂解液与5微升4倍样品缓冲液混合。将选定的天然蛋白标准品和15微升样品加样至凝胶中。在4摄氏度条件下，以25毫安电流电泳运行4小时。

当非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳完成后，拆卸凝胶并小心转移至SDS缓冲液中。在室温下轻轻振荡孵育10分钟。为每块凝胶准备两块海绵、四张纤维素滤纸和一张转印膜，并将其浸入转印缓冲液中。

按以下顺序从下至上组装三明治结构：一块海绵、两张纤维素滤纸、一张转印膜、凝胶、两张纤维素滤纸，以及一块海绵。将该三明治结构放入转印槽中，确保膜朝向正极，而凝胶朝向负极。

将预冷的转膜缓冲液加入转膜槽中。为获得最佳的蛋白质转移效果，建议在4°C条件下以90毫安的电流过夜转膜。次日，拆卸转膜“三明治”结构。

将膜在室温下置于丽春红 S 溶液中孵育五分钟，以显示蛋白质标准品。将膜放入去离子水中漂洗，进行脱色。将膜转移至托盘后，使用记号笔标记蛋白质标准品的条带。

用封闭缓冲液在室温下封闭膜至少一小时，或在4摄氏度下过夜。随后，按照文本方案中所述，使用针对MxA的兔多克隆抗体通过免疫染色可视化目标蛋白。缺乏内源性MxA的病毒细胞被转染了重组型野生型MxA以及单体和二聚体MxA变体。

重组MxA变异体在其预期的分子量处迁移，证实了其寡聚状态。异源表达的野生型MxA以四聚体形式迁移。随后利用这些重组蛋白评估了来自干扰素-α刺激的A549细胞的内源性人MxA蛋白的寡聚状态。

结果表明，经干扰素-α刺激的A549细胞裂解液中MxA蛋白的大小对应于四聚体。只要掌握该技术，若操作得当，可在一天半内完成。在进行该实验过程中，需特别注意在整个操作期间避免对样品进行冻融，因为这可能会破坏蛋白质相互作用或导致蛋白质聚集。

此外，在处理对光敏感的试剂（如碘乙酰胺）时，重要的是在裂解步骤中保护样品免受光照。在完成非变性 SDS-PAGE 后，可进一步进行蛋白质凝胶回收、酶活性分析或第二维 PAGE 等其他方法，以回答更多问题，例如酶活性以及潜在异源寡聚复合物的表征。该技术建立后，为细胞生物学领域的研究人员探索培养细胞中寡聚蛋白复合物的组成提供了重要途径。

观看本视频后，您应能充分掌握如何从细胞培养物中制备细胞裂解液，以在非变性PAGE分析中研究寡聚蛋白。请务必注意，碘乙酰胺具有极高的危险性，操作时应始终采取预防措施，例如佩戴手套和护目用具。