利用荧光显微镜观察链管频率

本实验的总体目标是利用活体细胞共聚焦荧光显微镜观察并测定叶片中叶绿体延伸结构（stromule）的发生频率，以及通过提取自叶片的叶绿体在体外观察 stromule。这些实验方法有助于解答植物细胞生物学和叶绿体研究中的关键问题，揭示 stromule 的功能机制。这些技术的主要优势在于，即使针对高度动态的叶绿体结构，也能获得可重复且可靠的数据。

我们之所以想到开展叶绿体分离研究，是因为一些研究表明，基质管（stromule）的形成需要细胞质结构（如细胞骨架）的参与。因此，我们决定将细胞研磨破碎，观察基质管是否仍能形成。准备叶片样品时，首先使用非常锋利的剃须刀片切割一小段本氏烟草（Nicotiana benthamiana）叶片。

切下叶片片段后，立即将其浸入装有5毫升水的注射器中。然后，排出注射器中的空气，并用手指堵住注射器开口以形成真空，再拉动活塞。轻轻松开活塞，避免损伤叶片片段。

然后重复脱气两到三次，或直至空气完全排出，叶片呈现深绿色。在载玻片上滴加一滴水，将叶片切片置于水滴上。接着在叶片上方再加一滴水，盖上盖玻片。

如果有气泡，请轻轻敲击盖玻片，直至气泡被去除。使用透射光和20倍物镜，对准叶片切片中心附近的视野，同时观察多个叶绿体。保存一张透射光图像，以便在必要时后续区分细胞类型。

然后切换至激光照明，并使用适用于所用荧光染料的适当激发和发射滤光片，再保存另一幅图像。在显微镜软件中选择 GFP 通道，点击调整针孔光阑至一个艾里单位。选择激光扫描以开始观察样品，然后点击 GFP 通道和探测器增益，在仍能清晰观察基质管状突起（stromules）的前提下尽量降低激光功率。

接下来，设置一个Z轴层扫实验，以采集视野中叶片表皮的连续图像序列。根据需要调整扫描速度和图像分辨率，确保快速完成Z轴层扫的采集。然后保存Z轴层扫数据以供后续分析。

使用 ImageJ 软件，通过最大强度投影将 Z 轴层叠图像合并为单张图像。随后在图像中识别并手动计数所有叶绿体。针对每个叶绿体，在合并后的 Z 轴层叠图像中目视判断是否有一个或多个从叶绿体延伸出的基质管状突起（stromule）。

为了提取完整的叶绿体，使用以下试剂配制冰冷的提取缓冲液。然后用 NaOH 和 HCl 将 pH 调至 6.9，并在使用前冷藏。配制分离缓冲液，并将 pH 调至 7.6。

如果叶片未表达遗传编码的基质荧光蛋白，请配制羧基荧光素二乙酸酯（CFDA）溶液。为分离叶绿体，从多株植物上取下约5至10克叶片，并用冷水短暂冲洗。然后立即将叶片转移至50毫升冷提取缓冲液中。

使用搅拌机以数次短时脉冲研磨叶片，然后通过两到三层纱布过滤混合物，以去除叶片残渣。将提取的叶绿体分装至两个50毫升离心管中，在750 × g条件下离心1分钟。弃去上清液，加入10毫升分离缓冲液重悬绿色叶绿体。

然后在750 × g下再次离心1分钟，弃去上清液，并用分离缓冲液将叶绿体重悬，终体积为5毫升。如果叶绿体来自表达质体靶向荧光蛋白的转基因植物，取20微升叶绿体悬液转移至载玻片上，加盖盖玻片，然后进行显微观察。

对于未表达质体靶向荧光蛋白的植物，若需对叶绿体进行染色，可将5微升50毫摩尔的CFDA储备液加入含5毫升叶绿体的分离缓冲液中。让叶绿体孵育5分钟后，取少量等分试样置于载玻片上，加盖盖玻片，进行显微观察。最后，使用FITC或GFP滤光片组配合20倍物镜，可同时观察多个叶绿体。

或使用更高倍的物镜来观察单个分离的叶绿体。此处展示的是在年轻本氏烟草幼苗的子叶中显示GFP气孔柄频率的合并图像。在该图中，图像经过去饱和和反相处理，使基质呈现黑色。

叶绿体被标记为无基质管状突起或至少具有一个基质管状突起。在观察到的87个表皮叶绿体中，有33个具有基质管状突起，占该叶片叶绿体总数的37.9%。该图展示了来自21株不同植物的单片叶片中超过23,000个叶绿体以及数百个细胞的分析结果。

白天平均的基质管频率为 20.8 ± 1.8%，夜间平均基质管频率为 12.8 ± 0.9%，Welch T 检验表明白天频率显著更高。在本图中，叶绿体基质管在体外被观察到，其来源包括表达质体靶向 GFP 的 N. benthamiana 分离材料，或使用 CFDA 对 N. benthamiana 或 Spinachia oleracea 的叶绿体进行染色后的材料。在进行基质管的活细胞成像时，应尽快操作，并尽可能减少对植物组织的扰动。

通过该实验步骤，研究人员可进一步结合基因沉默或化学处理等方法，探究参与链管形成及功能的其他分子因子或信号通路。该技术已被植物细胞生物学与植物免疫学领域的科研人员用于研究链管在细胞信号传导通路以及植物对病原体响应中的作用。观看本视频后，您应能够充分掌握如何计算叶片中链管的出现频率，以及如何观察分离叶绿体中的链管结构。

请记住，为扫描电子共聚焦显微镜提供动力的激光器和电压可能具有极大的危险性，了解使用该设备的系统要求至关重要。