表征微生物组动态——从纯培养到自然群落的基于流式细胞术的工作流程

该方法有助于回答微生物生态学和生物技术领域的关键问题，例如，哪些生态学概念驱动着特定的生态系统。该技术的主要优势在于，它能够在保持高度成本效益的同时，通过短时间间隔的采样方案，紧密追踪快速变化的微生物组动态。该方法可用于获取有关生物技术及自然微生物群落的信息，同时也可用于研究动物和人类微生物组，以评估营养与健康状态。

进行该操作演示的是我们实验室的技术员兼SediMeter操作员Florian Schattenberg。干燥沼气微生物群样本时，使用经改造的1毫升移液器吸头，将200微升黏稠的消化液转移至含有1.7毫升PBS的2毫升离心管中。充分混匀后，将离心管放入超声波水浴中处理1分钟，以分散可能存在的大块细胞聚集体，并使黏附在植物细胞残渣上的细胞脱落。

超声处理后，充分混匀样品，并通过孔径50微米的滤网将细胞过滤至2毫升塑料离心管中。将滤液均分为四份，每份400微升，将各份样品离心两次，每次均彻底弃去上清液，以尽可能充分地通过机械方式去除微生物样品中的水分。随后，将样品置于加热的真空离心浓缩仪中干燥，形成稳定的沉淀，并将沉淀物于4摄氏度避光保存。

为稳定和固定活性污泥样品，将4毫升细胞离心，并将沉淀重悬于4毫升含2%甲醛的PBS溶液中。室温孵育30分钟后，离心已稳定的细胞样品，并将沉淀固定于4毫升70%乙醇中，于-20摄氏度保存。充分混匀后，取0.6毫升固定后的细胞悬液转移至含有1.4毫升PBS的玻璃管中，彻底混匀后，按所示方法超声处理10分钟。

超声处理结束后，通过离心收集细胞，并将沉淀重悬于 2 毫升新鲜 PBS 中。充分混匀后，按照前述方法再次超声处理 5 分钟，并用新鲜 PBS 将 OD 700 纳米调整至 0.35。离心收集细胞，将沉淀重悬于 1 毫升透化缓冲液中，缓冲液含有 0.11 摩尔/升柠檬酸和 4.1 毫摩尔/升吐温 20，充分混匀后于室温孵育 20 分钟。

然后通过离心收集细胞，并将沉淀充分重悬于2毫升含有0.68微摩尔DAPI的染色液中，在室温下避光孵育至少60分钟。对于珠子校准，将用于线性校准的珠子混合液加入流式细胞仪，持续测量珠子，同时调节喷嘴和激光光学位置，以在线性范围内对仪器进行预校准。当珠子峰能够拟合到预设的校准模板时，切换至对数模式，并加载对数校准珠子样本。

将对数微球峰拟合到预设的校准模板，以微调仪器硬件，并利用光电倍增管增益设置对微球位置进行必要的最终调整。该流程中最关键的环节是保持测量的一致性，以确保不同实验之间的可比性。因此，每日对流式细胞仪进行校准，以及在生物样本中使用微球，对于实现稳定的流式细胞术微生物组透析至关重要。当细胞准备就绪后，混合并过滤样品，然后将对数微球混合物加入细胞中。

现在混合样本并将其上样至流式细胞仪，设置门控以包含染色的细胞，并排除噪声和微珠。随后以每秒最多3,000个事件的速度连续分析样本，直至在细胞门内检测到250,000个细胞。为分析流式细胞术数据，需建立一个主门控模板，并将其应用于所有样本。

首先将流式细胞术标准文件载入合适的流式细胞术分析软件，并依次处理样品。载入样品后，双击某次测量，然后从各自的下拉菜单中选择X轴和Y轴参数，以打开前向散射光与DAPI荧光图。使用多边形绘制工具重现先前设定的测量细胞门控，以排除微球和噪声，并将该门控命名。

将细胞门控条目拖动到所有样本组列表中，并双击该细胞门控以选择性地仅显示细胞事件。使用椭圆门控工具定义样本中占主导地位的亚群，并将其合并。然后添加额外的亚群划分及后续样本，直至主门控模板适用于所有样本。

通过侧向散射扫描方法控制主门控模板，以分辨彼此靠近聚集的亚群。然后，将所有亚群添加到表格编辑器中，并将输出统计量设置为父群频率。使用表格编辑器将相对亚群丰度导出至合适的电子表格软件，并根据侧边栏手册中的指南调整数据格式。

然后，为了可视化亚群落的动态变化和相关性，安装并加载 R 软件包，导入并归一化 txt 文件。前向散射与 DAPI 荧光图可揭示分批培养过程中不同时间点纯菌株培养物的细胞周期状态。使用主门控模板可定量具有一个、两个或多条染色体的细胞比例，从而揭示该代表性微生物复制其染色体的速度快于其世代时间的能力。

在随时间研究复杂的微生物群落时，可通过点图序列直观地展示群落变化的速度和重要性。利用流式细胞条形码工具，可以清晰识别实验不同阶段中的优势亚群落。将此数据与各亚群落相对丰度的频率分布相结合，可筛选出在关键时间点表现出显著丰度变化的门控区域。

在非度量多维尺度图中对这些数据进行可视化，有助于深入理解群落动态。由于搅拌受限，沼气群落可能面临空间异质性问题。示例性沼气群落采样点表现出较弱的空间异质性，但具有显著的时间异质性。

与产品紧密度等非生物参数存在强正相关或负相关关系，有助于理解并优化生态系统和生物技术过程。此外，这些相关性有助于识别具有特殊兴趣的目标群体，以便进行后续分选和分析。在建立该流程时，建议评估不同的固定和染色方法，以确定其在每批新样本中的表现和稳定性。

分选完成后，可进一步采用扩增子测序、宏基因组学和蛋白质组学等方法，筛选出最具代表性的微生物群落，从而获取有关代谢通路中潜在基因归属及活性状态的信息。该方法为微生物生态学家和生物过程工程师提供了研究自然和受控生态系统中微生物组动态变化的有效途径，且资源投入合理。