高通量机器人辅助分离温度敏感致死突变体 莱茵衣藻

该实验方案的总体目标是利用机器人技术和标准化检测方法，简化对衣藻中温度敏感致死突变的筛选，从而确定该生物体内的必需基因及其相关通路。我们关注真核生物中必需细胞功能的保守性与差异性，而研究这一问题的方法就是通过影响这些过程中必需基因的突变。

为了使该方法有效，需要一个非常全面的突变体集合，而您将要听到的方法正是我们用于构建此类集合的技术。我们以绿色藻类莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）作为植物界的一个代表性模式生物。该技术的主要优势在于，可能在每一个必需的生物学通路中都发现温度敏感型致死突变。

该方法无需预先了解基因功能或进行靶向诱变。从致死表型可直接推断突变基因的分子功能。这有助于我们筛选出影响多种唾液酸化通路（超出细胞周期调控范围）的有趣突变。

在25摄氏度光照条件下，于100毫升Tris-乙酸盐-磷酸盐（TAP）培养基中振荡培养衣藻细胞（100 rpm），使其OD750达到0.2至0.5。根据文本方案，紫外线（UV）诱变在两种不同的遗传背景下独立进行。取每种培养物样品在显微镜下检查，以确认细胞具有活性且无污染。

接下来将培养物稀释至 OD 750 为 0.003，然后用铝箔纸包裹瓶体，以确保培养物密度均匀，因为该菌株具有趋光性，会朝光的方向定向游动。根据文本方案调整菌液浓度后，安装一个适配液体分配器的小型管盒，按照制造商说明进行一系列清洗以实现灭菌，防止污染。使用八通道注射器液体分配器管盒，将四组各96滴、每滴2 µL的培养液点样到干燥的矩形平板上。

轻轻敲击培养皿边缘，确保所有液滴融合成一层均匀的薄液膜，并立即盖上皿盖以避免光照。待液体干燥后，将培养皿置于杀菌紫外灯下照射一定时间，该时间需通过实验经验确定，以使存活菌中温度敏感型突变体（ts突变体）的产量达到最佳。随后，将培养皿转移至暗处，在室温下放置8至24小时。

然后将平板置于21摄氏度、有光照的培养箱中。培养约10天后，当菌落已生长但尚未融合时，将平板放入相应的堆栈中，作为机器人挑取菌落的来源。随后在矩形平板上挑取菌落制备384阵列，并在21摄氏度、有光照条件下培养约一周时间。

使用复制平板机器人，将384孔阵列压缩为1536孔阵列，并将平板置于21°C培养箱中培养约三天。将1536孔阵列分别复制到两块平板上，一块置于21°C培养箱中，另一块置于33°C培养箱中。在33°C下培养24小时后，将来自33°C培养箱的平板复制到一组预热的新平板上，并将其放回33°C培养箱中。

在33摄氏度下培养三天，随后在21摄氏度下培养五天后，使用数码相机拍摄带有九个对齐标记的网格平板。然后交替拍摄21摄氏度和对应的33摄氏度平板，将所有平板置于固定框架中以保持精确的方向一致。使用定制的Matte Lab图像分析软件处理成对的21摄氏度和33摄氏度平板图像，以去除背景并将图像分割为1536阵列。

该程序将根据每个位置的总像素强度来确定检测到的生物量。将软件生成的选定菌落列表作为指令文件载入单菌落挑取机器人系统。然后根据机器人的操作说明准备源平板和目标平板，并让机器人将选定的菌落挑取至阵列中。

将目标平板置于21摄氏度培养箱中培养约五天，以制备库存平板。在完成第二次生物量积累检测并根据文本方案复制100块平板后，将该100块平板的新鲜副本再复制三份。在机器人中完成第三块平板的设置并点样菌落后，对筛选平板上每个点样区域在零时点拍摄显微照片，随后将平板置于33摄氏度培养箱中进行培养。

在将筛选平板从33摄氏度培养箱中取出后的不同时间点，迅速拍摄显微照片，确保平板固定装置和载物台控制器精确校准，以便在每个时间点获取相同细胞的图像。分析显微图像，并根据预定标准筛选突变体。将最终选定的突变体点种至96孔阵列琼脂平板上，确保每块平板中的突变体具有相同的交配型和药物抗性。

将大量排列好的菌落转移至96孔微孔板中的无氮配子诱导培养基中。将微孔板置于光照条件下孵育约五小时，以诱导配子形成。将含有相反交配类型及不同抗性盒的菌株悬浮于含有无氮配子诱导培养基的离心管中，进行配子形成。

将目标板中的样品与20微升的交配混合液体积混合。在光照条件下约10分钟后，从每个孔中分别取5微升样品点样两次：一次点在TAP平板上用于连锁检测，另一次点在含有5微摩尔帕罗霉素和9微摩尔潮霉素的TAP平板上用于互补检测。

在培养互补测试平板后，将平板复制成两份以进行温度敏感（ts）表型鉴定。根据文字方案对菌落进行ts表型检测。在对衣藻单细胞进行诱变处理后，细胞在允许温度下生长十天，然后以阵列形式挑取，如此处所示。

将获得的384孔板合并为1536阵列。测试了三种紫外照射时间以产生衣藻（Chlamydomonas）温度敏感型（ts）突变体。根据经验，1.5分钟的照射时间产生的ts突变体最多。

然而，迄今为止，一分钟的暴露时间获得了最多的细胞周期候选基因。在本实验中，进行了两次连续的温度敏感型表型检测，分离并利用延时显微镜对约3000个温度敏感型突变体进行了表型表征。如图所示，为了从下游分析流程中剔除高频出现的基因，对新获得的候选基因进行了互补实验和连锁检测，检测对象为已知的具有两个以上等位基因且已被表征的基因。

这些菌落与查询基因无互补现象，因此是该查询基因的新型温度敏感等位基因。这类菌落通常被排除在进一步表征之外。一旦掌握，该技术可实现高通量操作。

仅通过两到三轮诱变，便可分离出数千个温度敏感型突变体。分离得到温度敏感型突变体后，关键的一步是筛选出其中一部分用于后续研究，而观察这些突变体致死表型的多样性则尤为引人关注。表型分析可为基因的分子功能提供线索，同时也有助于我们确定后续研究中优先深入探究的突变体。

需要注意的是，突变体的基因组中可能含有数百甚至数千个突变。通常只有一个突变是致病原因，但有时需要两个突变共同作用才会产生温度敏感（ts）表型，这种情况可通过四分体分析来确定。通过本流程，可利用高通量测序技术对突变体混合样本进行测序分析，从而鉴定出致病突变。所鉴定出的基因有时会携带提示其功能的突变，也可能是功能未知的新序列，这既具有科学意义也令人兴奋。

衣藻一直是研究植物界细胞生物学的极佳模式系统。你所听到的这些实验方法将有助于开展对该生物体重要生命过程的研究，而这些过程此前相对较少被探究。我们希望，这些研究成果也将适用于更广泛的植物界。