活细胞正向遗传学方法用于鉴定和分离Chlamydia trachomatis中的发育突变体

本方案提供了一种独特的工具，用于生成并分离具有改变发育特征的沙眼衣原体，最终实现调控其发育周期相关基因的鉴定。该方法的主要优势在于能够实时追踪衣原体细胞类型的发育过程，并能够分离出具有改变发育程序的衣原体。为对沙眼衣原体报告菌株进行诱变，需准备一管衣原体储备液，其中含有约3×10⁷个原体。

将含有目标报告质粒的样品离心形成沉淀后，通过离心收集转化后的细胞。加入100微升的随机代谢缓冲液，以10%功率超声处理10秒，重悬初体（elementary bodies），并将所得的初体悬液等分为两份，分别加入两个1.5毫升微量离心管中。向用于诱变的衣原体等分样品中加入50微升 freshly prepared EMS代谢溶液，仅用于保存的衣原体等分样品中则加入50微升vaccinic代谢缓冲液，随后将两份样品于室温孵育20分钟。

EMS 是一种已知的致癌物，操作时应佩戴手套，并将所有被 EMS 污染的器械和培养基在 1 摩尔的氢氧化钠溶液中浸泡 24 小时后再行处理。为建立大规模培养物以进行突变化沙眼衣原体的成像与分离，将六孔玻璃底培养板每孔接种 6 × 10⁵ 个 C. trachomatis 细胞，每孔加入 2 毫升完全培养基；同时将 24 孔聚苯乙烯培养板每孔接种 1 × 10⁵ 个 C. trachomatis 细胞，每孔加入 1 毫升完全培养基。

用诱变处理的沙眼衣原体感染宿主细胞培养物时，在玻璃底培养板中加入约6 × 10⁵个诱变后的原体，每孔加入1.5 mL冰上预冷的HBSS。在另一孔中加入约2 × 10⁵个未进行诱变处理的对照原体，每孔同样加入1.5 mL冰上预冷的HBSS。于37°C振荡孵育15分钟后，使用添加了1 mg/mL肝素的37°C HBSS洗涤感染细胞，随后立即用HBSS冲洗一次。

再次用肝素洗涤细胞，随后立即用HBSS单独冲洗两次，以确保完全去除所有肝素。最后一次洗涤后，向每个孔中加入4毫升37摄氏度的成像培养基，并在孔间区域加入37摄氏度的去离子水，然后将培养板放入细胞培养箱中孵育10小时。

孵育结束后，将显微镜载物台培养箱设置为5%二氧化碳、37摄氏度。将六孔玻璃底板放入载物台培养箱中。在成像软件中，使用高内涵筛选插件选择六孔板模板，并生成每个孔包含12个视野的成像位置列表；使用自动对焦功能设定自动成像的焦距，设置GFB通道的曝光时间为250毫秒、强度为4%，RFP通道的强度为18%。

在24小时的成像周期中，以30分钟为间隔，捕获发育周期的动力学过程，并设置图像采集包含多个Z轴层叠，其聚焦范围需覆盖处于焦点位置切片两侧的区域，然后选择用于成像的相对Z轴位置，在采集窗口中设置多个切片，并使用图像堆栈文件选项，将图像保存为TIFF堆栈文件。为了识别具有不同发育特征的包涵体轨迹，可使用EMS界面中的导入细胞功能，通过Markdown Python笔记本，将来自轨迹统计spots的CSV文件中的包涵体轨迹数据导入Pandas数据框中。

使用计算单元计算每条轨迹中早期和晚期报告基因达到最大表达所需的时间，并在“半最大值绘图”单元中使用 Bokeh 绘图包，将表达量达到半最大值的时间相对于 hctB 启动子进行可视化。利用 Bokeh 交互式轨迹 ID 浏览器，识别突变群体中偏离模拟处理散点云的包涵体。在动态动画血细胞图中，通过 EOU 启动子相对于 hctB 启动子的表达强度变化，动态可视化启动子表达动力学的改变。

然后在包含体定位细胞中，观察动态图谱中的某一帧图像。为了从目标包含体中分离出发育中的衣原体，将视野对准一个已识别出包含体的孔，使针头经过相差干涉显微镜的白光通道光源，以观察针头位置；使用595纳米激发通道观察用于提取的原体。接着利用微调装置和显微操作仪，将毛细玻璃针移至包含体位置，用针头刺破包含体，并通过显微注射仪将原体吸入毛细玻璃针尖内。

将提取的原体从毛细玻璃针头推出，注入已准备好的24孔聚苯乙烯板中的单个孔内，下一提取步骤需使用新的毛细玻璃针头。待每个分离株充分扩增后，用1毫升微量移液器吸头破坏感染的单层细胞，将培养基、细胞碎片及释放出的沙眼衣原体转移至新的1.5毫升微量离心管中。通过离心收集沙眼衣原体沉淀，将沉淀重悬于75微升冰上预冷的蔗糖磷酸盐谷氨酸缓冲液中，随后将包涵体悬液等分为三份，分别加入三个新的1.5毫升螺口微量离心管中，并将离心管储存于-80至-70摄氏度条件下。

为建立用于成像 mutagen ISED 分离株的宿主细胞培养体系，需在96孔玻璃底板中每孔加入100 µL完全培养基和1.6 × 10⁴个COS-7细胞进行接种。待宿主细胞单层达到汇合状态后，将收获的突变克隆和野生型沙眼衣原体（Chlamydia）毒株置于冰上解冻，并为每个分离株使用一列进行两倍系列稀释。用野生型沙眼衣原体以约0.5的感染复数（MOI）感染剩余的一列，随后将培养板置于细胞培养箱中孵育10小时。孵育结束后，为每个突变分离株选择三个感染复数低于1的孔，并生成成像位置列表。

每个孔包含两个视野。在此散点图中，可以观察到不同沙眼衣原体分离株的EOU和hctB启动子达到半数最大表达所需的时间。克隆株A3667和B3858被选中进行分离，因为它们的EOU启动子达到最大表达所需时间较短，而hctB启动子所需时间较长。通过可视化两种启动子的动态基因表达，可识别出具有改变表达动力学的包涵体，并可利用该动态图的某一帧快照来确定目标包涵体的位置。

在这些代表性可视化结果中，共鉴定出24个包涵体用于分离，其中10个在三种不同表型类别中重新检测时表现出差异性动力学特征。8个分离株在感染后约24小时表现出EOU启动子表达水平下降。如A3667克隆所示，B3858分离株也在感染后约24小时表现出EOU启动子表达下降，但hctB启动子表达总体上升；而B3662分离株则表现为EOU启动子荧光信号增强，随后在两个启动子中均突然丧失表达。

对突变株B3662的活细胞显微图像分析显示，在感染该突变株的细胞中，宿主细胞裂解发生的时间明显早于感染野生型的细胞。由于这些细胞无法再次感染宿主，可能导致无法回收细胞类型发育缺陷的衣原体。在分离后，可通过全基因组关联分析，结合替代启动子报告基因的引入，通过统计学相关性鉴定参与发育过程的基因。

该方法可拓展应用于多种遗传通路的研究、遗传回路机制的解析，以及其他细胞内病原体的探究。