利用拼接技术扩展纳米图案化基底以调控细胞行为的纳米形貌

本实验的总体目标是通过一种简单、经济且多功能的拼接技术，利用小型纳米图案化模具制备大面积的纳米图案化基底。该方法有助于在细胞和分子水平上研究基底纳米形貌对细胞表型和功能的调控作用，例如黏着斑蛋白的表达。该技术的主要优势在于其操作简便且成本低廉。

首先，按照文本方案中的描述，将硅烷化硅胶模具置于PDMS预聚体中进行准备。将硅烷化硅胶模具放入60毫米的培养皿中。将PDMS预聚体倒入培养皿中的硅胶模具上。

将培养皿放入塑料干燥器中抽气约10分钟，直至所有气泡消失。将培养皿转移至加热板上，在70摄氏度条件下固化PDMS预聚物4小时。使用镊子小心地将PDMS模具从硅胶模具上剥离下来。

在光学显微镜下确定各向异性PDMS纳米图案（如纳米光栅）的取向，并用记号笔在PDMS模具背面标记其方向。在通风橱中用乙醇清洗硅基底，然后用压缩空气吹干。使用刀片切除每个PDMS模具上的无图案区域。

PDMS模具应尽可能紧密排列，但不得接触周围的模具，以最小化未图案化区域，并避免在施加压缩力时导致纳米图案变形。将裁剪好的PDMS模具的纳米图案面朝下放置在硅基底的镜面侧，然后将其他模具排列在附近，但不得接触周围的模具。关键是要尽量使PDMS在底层完全固化，因为未固化的PDMS可能通过多个模具之间的间隙流动，从而损坏纳米图案。

然而，完全固化的PDMS无法将多个模具粘合在一起。为了制备PDMS粘合层，将一克脱气后的PDMS预聚物浇注在洁净的玻璃载片上，形成厚度为0.5毫米的薄层。将PDMS层置于加热板上，在100摄氏度下烘烤三至五分钟。

使用针头接触该层，确保该层部分但未完全固化。将PDMS层置于对齐的PDMS模具背面，迅速翻转此组装件，并转移至加热板上。在组装件上方使用金属块施加压力，以确保PDMS粘合层与PDMS模具背面之间良好接触。

将PDMS粘附层在100摄氏度下固化一小时。关闭加热板，取下金属块，并从硅基底上剥离单次拼接的PDMS模具。为了将拼接的PDMS模具纳米压印到PS板上，将PS板放置在置于三英寸硅片上的铝制垫片中。

将聚苯乙烯（PS）板置于加热板上，在 250 摄氏度下加热 30 分钟。然后，将带有纳米图案的一面朝下的拼接 PDMS 模具放置在熔融的 PS 板上。接着，将铝板放置在拼接 PDMS 模具的玻璃载片上。

在铝板上使用金属块施加压缩压力，并等待三分钟。将金属块从铝板上抬起并重新放置，将压缩压力增加至25千帕。然后，将压力增加至50千帕，重复此步骤。

在持续 50 千帕斯卡的压力下，将加热板的温度维持在 240 至 250 摄氏度之间，持续 15 分钟。关闭加热板，使整个装置冷却。待温度降至 50 摄氏度以下后，取下金属块，并小心地将缝合的 PDMS 模具从 PS 板上剥离下来。

为了在聚苯乙烯（PS）薄膜上进行纳米压印，将具有纳米形貌的一面朝下放置拼接好的PDMS模具于PS薄膜上，PS薄膜置于加热板上。通过在PDMS模具的玻璃载片上放置金属块，对PDMS模具施加12千帕的压缩压力。将加热板的温度升至180摄氏度，并保持15分钟。

关闭加热板，使整个装置冷却。当温度降至50摄氏度以下时，取下金属块，并小心地将带有缝合结构的PDMS模具从PS薄膜上剥离。使用空心钢制圆筒冲孔器，将具有纳米图案的PDMS基底切割成适合特定多孔板配置的圆片状。

然后，使用镊子将PDMS圆片放入多孔板的孔中。用70%乙醇处理PDMS基底30分钟以进行灭菌。随后吸除乙醇，并进行紫外线照射30分钟。

用1倍无菌磷酸盐缓冲液将PDMS基底洗涤三次。接着，在室温下用细胞外基质蛋白孵育PDMS基底30分钟。再用无菌PBS将PDMS基底冲洗三次，每次五分钟。

将人 A549 肺癌细胞悬浮于含 10% 胎牛血清的杜尔贝科改良伊格尔培养基中，并使用血细胞计数板对细胞进行计数。以每平方厘米 2,000 个细胞的接种密度将细胞接种于 PDMS 基底上。在 37°C、含 5% 二氧化碳的湿润环境中培养细胞一天，随后进行观察。

此处展示了在PS板和薄膜上生成的纳米图案。箭头指示了聚合物在拼接PDMS模具间隙中隆起的部分。这些SEM图像表明，通过应用拼接技术，PDMS工作基底能够忠实地将电子束光刻所写的纳米图案进行转移。

此处展示了在纳米光栅和纳米柱上生长的A549细胞的代表性扫描电镜图像。细胞在纳米光栅上呈现定向排列的形态，而在纳米柱上则随机铺展。观看本视频后，您应能够充分理解如何通过拼接多个小面积定义的纳米图案化模具来制备大面积纳米图案化基底。

请务必注意，使用甲苯和多聚甲醛可能具有极高危险性，进行操作时应始终穿戴适当的个人防护装备。